肺腺癌細胞においてミトコンドリアに局在するOCIAD2の機能的意義の検証

• 研究課題/領域番号: 19K07455
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 基金
• 応募区分: 一般
• 審査区分: 小区分49020:人体病理学関連
• 研究機関: 筑波大学
• 研究代表者: 柴 綾 筑波大学, 医学医療系, 准教授 (50708427)
• 研究分担者: 野口 雅之 筑波大学, 医学医療系, 教授 (00198582)
• 研究期間 (年度): 2021-01-01 – 2024-03-31
• 研究課題ステータス: 交付 (2022年度)
• 配分額: 4,420千円 (直接経費: 3,400千円、間接経費: 1,020千円); 2021年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円); 2020年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円); 2019年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
• キーワード: 肺腺癌 / アポトーシス / ミトコンドリア / OCIAD2

研究開始時の研究の概要

申請者はこれまでに浸潤性肺腺癌においてミトコンドリア（Mt）に局在するタンパク質OCIAD2が過剰発現していることを見出した。OCIAD2発現は患者予後と負に相関しており、腫瘍悪性化との関係が示唆される。本研究ではOCIAD2のMtにおける機能に焦点を絞り、OCIAD2を発現抑制した肺腺癌細胞を用いて増殖やアポトーシスに与える影響をin vitroで解析する。さらにアポトーシス誘導に着目し、OCIAD2が関わっている可能性を蛍光免疫染色、電子顕微鏡法、ELISA法などで検証する。最終的にはOCIA2機能の分子機序を明らかにし、浸潤性肺腺癌におけるOCIAD2過剰発現の機能的意義を見出す。

研究実績の概要

OCIAD2は浸潤性肺腺癌において過剰発現している遺伝子であり、正常肺では発現がないため 非常に腫瘍特異性が高い。高発現群は低発現群に比べて有意に予後不良であり、肺腺癌の悪性化において何らかの機能を持つことが示唆される。本研究ではOCIAD2のミトコンドリアにおける機能に焦点を絞り、OCIAD2を発現抑制した肺腺癌細胞を用いて増殖やアポトーシスに与える影響をin vitroで解析する。
本研究課題により、OCIAD2はミトコンドリア膜に局在することが確認され、OCIAD2をノックダウンすることにより１細胞当たりのミトコンドリア数、１ミトコンドリア当たりのクリステ数が顕著に減少し、OCIAD2はミトコンドリアの形態維持や機能に何かしらの働きを持っていると考えられた。次に、OCIAD2をノックダウンした肺腺癌細胞でアポトーシスを検出すべく、caspase等の活性測定やAnenxin Vをマーカーとした細胞膜構造変化解析、チクロトームcの発現・局在解析を行った。その結果、OCIAD2ノックダウンによりチトクロームcの放出やcaspase-3,9, PARPの開裂が見られ、アポトーシスが誘導されていることが明らかになった。さらに、ミトコンドリア膜電位がOCIAD2ノックダウンにより低下することもわかり、OCIAD2が膜電位の維持に寄与している可能性が示唆された。
OCIAD2をノックダウンした3種の細胞を用いたRNA-seqを実施し、OCIAD2がpro-apoptotic initiator, cell cycle, ER stressなどに係る遺伝子を制御している可能性が示され、今後はOCIAD2がアポトーシス抑制という機能を果たすためにkeyとなる因子の同定を目指す。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

研究計画通りに進行しており、残り1年で当初計画していた内容は完了できると見込まれる。

今後の研究の推進方策

これまでの研究からOCIAD2が肺腺癌細胞のアポトーシス抑制に寄与している可能性が示されている。OCIAD2がミトコンドリア膜上で何らかのタンパク質に結合することでその機能を果たしていると予想し、肺腺癌細胞からミトコンドリア分画のタンパク質を抽出し、OCIAD2抗体を用いたIP（免疫沈降）/LC-MS解析を行いOCIAD2結合タンパク質を網羅的に同定する。同定されたタンパク質の中からミトコンドリア膜に局在するものを選別し、そのタンパク質とOCIAD2がどのように相互に係るかを解析する。特に、チトクロームc放出はBcl-2が抑制的に、Baxが亢進的に制御していることが知られているため、Bcl-2ファミリーが結合因子として上がってきた場合は着目して解析する。