| 研究課題/領域番号 |
19K07696
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分50010:腫瘍生物学関連
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| 研究機関 | 慶應義塾大学 |
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研究代表者 |
大西 伸幸 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 訪問研究員 (40534540)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| 研究課題ステータス |
完了 (2021年度)
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| 配分額 *注記 |
4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)
2021年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2020年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2019年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
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| キーワード | ゲノム編集 / ゲノム編集タンパク質 / 遺伝子改変動物 / 遺伝子改変マウス作製法 / In vivoエレクトロポレーション / Cas9タンパク質 / Transposaseタンパク質 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
CRISPR/Cas9システムによるゲノム編集の技術革新は他に類を見ない。CRISPR/Cas9ヌクレアーゼの発現ベクターや精製タンパク質が一般に入手できるようになったことで、目的遺伝子ノックアウト細胞の作製が身近になり研究室レベルで頻繁に挑戦されるようになったが、研究室単位で遺伝子改変マウスの作製を行うにはまだまだハードルが高いのが現状である。申請者はこれまでに構築してきたpiggyBac/in vivoエレクトロポレーション法によるin vivo遺伝子発現システムとGONAD法を組み合わせることで迅速かつ簡便な遺伝子改変マウス作製法の樹立を目指す。
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| 研究成果の概要 |
本研究では、大腸菌タンパク質発現系を用いて、高精度型Cas9であるHypaCas9タンパク質をgRNAと同時に発現させ、リボヌクレオプロテインとして精製するシステムを構築した。大腸菌株の選定やタンパク質発現誘導条件・大腸菌破砕法を最適化することで、シングルバンドでHypaCas9タンパク質を精製することができた。具体的には、Cas9タンパク質合成で一般的に用いられているRosetta2(DE3)ではなくBL21(DE3)を採用し、低温ではなく30℃での発現誘導を行い、超音波ではなく凍結融解法ならびにリゾチームを用いてマイルドな条件で大腸菌破砕することで夾雑タンパク質を減少させることができた。
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| 研究成果の学術的意義や社会的意義 |
CRISPR/Cas9ヌクレアーゼの精製タンパク質が一般に入手できるようになったことで、目的遺伝子ノックアウト細胞の作製が身近になり研究室レベルで頻繁に挑戦されるようになったが、細胞一つ一つで切断された遺伝子配列の修復様式が異なるため、クローン化する必要がある場合は細胞株樹立までに長い期間を要する。ましてや研究室単位で遺伝子改変マウスの作製を行うにはまだまだハードルが高いのが現状である。本研究を進めていくことで、迅速かつ簡便に遺伝子改変マウスを作製することが可能となり、多様な疾患ならびに治療モデルの構築に挑戦していくことで、有効な治療法が無い疾患に対して新たな治療法開発に貢献することができる。
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