| 研究課題/領域番号 |
20H00444
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| 研究種目 |
基盤研究(A)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
中区分42:獣医学、畜産学およびその関連分野
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| 研究機関 | 筑波大学 |
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研究代表者 |
杉山 文博 筑波大学, 医学医療系, 特命教授 (90226481)
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| 研究分担者 |
村田 知弥 筑波大学, 医学医療系, 助教 (60713485)
久野 朗広 筑波大学, 医学医療系, 助教 (60830122)
水野 聖哉 筑波大学, 医学医療系, 准教授 (10633141)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
45,110千円 (直接経費: 34,700千円、間接経費: 10,410千円)
2023年度: 9,620千円 (直接経費: 7,400千円、間接経費: 2,220千円)
2022年度: 9,360千円 (直接経費: 7,200千円、間接経費: 2,160千円)
2021年度: 12,610千円 (直接経費: 9,700千円、間接経費: 2,910千円)
2020年度: 13,520千円 (直接経費: 10,400千円、間接経費: 3,120千円)
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| キーワード | 原腸胚形成 / 選択的スプライシング / ゲノム編集 / 胚盤胞補完法 / 原腸胚 / マウス / RNA結合タンパク / スプライシング関連タンパク |
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| 研究開始時の研究の概要 |
申請者は、①胚葉可視化(MIERU)マウスの遺伝背景で原腸形成に不可欠なRNA結合タンパク(RBP)を欠損するRBP-ノックアウト（KO）マウス系統群を樹立する。②各RBP-KOマウスの胚葉特異的なロングリードトランスクリプトームデータソースを構築し、特徴的なスプライシングバリアントと表現型を紐付ける。③特徴的なスプライシングバリアント（SV）の機能を評価するため、標的のエクソンを欠失させたSV-KOマウス系統を作出・in vivo評価を開始することにより、選択的スプライシングの機能的意義の包括的な理解を目指す。
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| 研究実績の概要 |
本研究では我々独自の蛍光ノックインマウスを利用して、原腸胚形成における各胚葉で機能的なスプラシングバリアントの特定を目指す。
本年度は、各々の胚葉を蛍光で識別可能なMIERUマウス(外胚葉マーカーとしてOtx2遺伝子にtdTomatoが、中胚葉マーカーとしてT遺伝子にTagBFPが、内胚葉マーカーとしてSox17遺伝子にEGFPがそれぞれbicistronicにノックインされている）ES細胞にCRISPR-Cas9を導入し、ある共通的な特徴をもつ遺伝子群のそれぞれに対するgRNAと組み合わせ、三胚葉が可視化可能な潜在能力を持つKO-ES細胞を12系統樹立した。なお、各系統で少なくとも2つ以上の独立したクローンが得られており、KOアレルの配列も決定している。これらのES細胞から胚盤胞補完法を用いることで、三胚葉可視化KO-原腸胚を発達させた。更に、胚葉毎異なる蛍光タンパクを利用したFACSにて胚葉特異的な細胞集団を分取した。なお、非遺伝子破壊MIERUマウスES細胞を用いたコントロール実験において、各胚葉特異的な細胞分取が成功したことをRNA-Seq解析で確認している。
スモールサンプルからスプラシングバリアントを特定することが可能であると報告されたあるRNA-Seq法により、上述の三胚葉可視化KO-原腸胚から分取した胚葉特異的な細胞集団における遺伝子発現解析を実施した。これまでに6遺伝子の三胚葉可視化KO-原腸胚の遺伝子発現解析データを所得済みであり、現在はそのデータ解析を実施している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究の基盤ツールであるMIERUマウスとそのES細胞の確立に既に成功しており、標的遺伝子の選定と遺伝子破壊も当初の予定通りに完了した。また、それら遺伝子破壊ES細胞を原腸胚へと発生させる系やその後の細胞系譜特異的な分取も滞りなく進んでいる。その後の遺伝子発現解析系もコントロール実験では期待通りの結果が得られており、これまでに構築した系と細胞ライブラリーを用いて、実験を進める環境は完備された。
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| 今後の研究の推進方策 |
残りの遺伝子についての三胚葉可視化-KO原腸胚を微量サンプルに特化したRNA-Seqで解析していく予定である。そして、スプライスバリアントに差が見られる遺伝子を抽出し、アンプリコンシークエンスでのナノポアーシークエンシング解析を実施、詳細なデータを得る。これらのデータをもとにKO異常胚葉形成の特徴と原因候補スプライシングバリアントを炙り出す予定である。
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