| 研究課題/領域番号 |
20H03155
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分42020:獣医学関連
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| 研究機関 | 自治医科大学 |
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研究代表者 |
加藤 大智 自治医科大学, 医学部, 教授 (00346579)
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| 研究分担者 |
新井 明治 香川大学, 医学部, 准教授 (30294432)
水島 大貴 自治医科大学, 医学部, 助教 (50843455)
山本 大介 自治医科大学, 医学部, 准教授 (90597189)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
17,420千円 (直接経費: 13,400千円、間接経費: 4,020千円)
2023年度: 5,330千円 (直接経費: 4,100千円、間接経費: 1,230千円)
2022年度: 5,460千円 (直接経費: 4,200千円、間接経費: 1,260千円)
2021年度: 2,990千円 (直接経費: 2,300千円、間接経費: 690千円)
2020年度: 3,640千円 (直接経費: 2,800千円、間接経費: 840千円)
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| キーワード | 吸血昆虫 / ハマダラカ / サシチョウバエ / 腸内細菌 / 糖類 / 病原体媒介能 / 中腸 / リーシュマニア / マラリア / 蚊 / マラリア原虫 / リーシュマニア原虫 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
病原体媒介性吸血昆虫（ベクター）の体内では、どのような状況で病原体の発育や増殖が促進され、どのような状況では阻害されるのか、病原体媒介の成否に直結するこのイベントの分子機構は明らかではない。本研究では、抗生物質や希少糖の投与といった簡便な方法で病原体の発育・増殖能力を阻害（または促進）したベクターを用いて、ベクター内での病原体の発育や増殖の場となる「中腸」に発現する分子を比較解析し、病原体媒介能を規定するベクター中腸分子の解明を目指す。
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| 研究実績の概要 |
病原体媒介性吸血昆虫（ベクター）の体内でどのような状況で病原体の発育や増殖が促進され、どのような状況では阻害されるのか、病原体媒介の成否や効率に直結する分子機構は明らかではない。本研究では、抗生物質や希少糖の投与で病原体の発育・増殖能力を攪乱したベクターを用いて、病原体媒介能を規定する中腸分子の解明を目指す。本年度の研究実績の概要は次の通りである。1）抗生物質投与によってマラリア原虫の感染が亢進したハマダラカで発現変動する遺伝子を網羅的に解析した。これらの蚊では、マラリア原虫の感染防御に働くと報告される免疫関連遺伝子群の有意な発現変動は見られなかった。一方、囲食膜関連遺伝子群や、近年他の節足動物から発見された新規抗菌ペプチドの相同分子の発現低下を認めた。2）蚊において、1）で見つかった新規抗菌ペプチド遺伝子のノックダウンを試みている。現在至適条件検討中で、ノックダウン蚊におけるマラリア原虫感染を行う予定である。3）抗生物質で処理したハマダラカにおいて希少糖のマラリア原虫発達阻害効果を検討した。その結果、腸内細菌の有無に関わらず、同等の阻害効果を発揮することを明らかにした。4）ハマダラカ雌成虫の中腸特異的に発現するアミノペプチダーゼNファミリーの１分子(apnl)のノックアウト系統では雌の産卵数が低下するため、血液消化が不十分な可能性が考えられた。中腸組織切片標本を作製し観察を行ったが、apnlは血球の分解に関与している可能性は低いと考えられた。5）サシチョウバエにおけるlarval RNAi法の確立を行った。性分化遺伝子dsxに対するdsRNAを終齢幼虫に注入し、蛹化後の遺伝子発現量を検討したところ遺伝子発現量の低下が確認できた。本法は成虫初期から吸血や病原体感染に関わる中腸遺伝子などの機能解析が可能になる。今後は遺伝子発現阻害効率を上げるために更なる条件検討を行う。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
抗生物質をハマダラカに投与すると、マラリア原虫の感染が亢進することが知られている。このモデルを用いて、抗生物質投与の有無で、蚊の体内でどのような分子レベルの変化が起きているのか、感染血を吸血した1日後と3日後の遺伝子発現変動を、RNAseqとオリジナルのマイクロアレイによって解析した。両解析によって発現変動を認めた遺伝子の一部をさらに定量PCRで確認したが、これらの蚊では、マラリア原虫の感染防御に働くと報告される免疫関連遺伝子群の有意な発現変動は見られなかった。一方、囲食膜関連遺伝子群の発現低下がみられ、囲食膜のバリア形成が弱まっていることがマラリア原虫感染増強に関与することが示唆された。また、近年他の節足動物から発見された新規抗菌ペプチドの相同分子の発現低下を認めたが、これについては、dsRNAやsiRNAを用いて、効率よく遺伝子ノックダウンを行う条件を検討している。
希少糖によるマラリア原虫発達阻害効果の解明を目指し、抗生物質で処理したハマダラカを用いて腸内細菌の影響を検討した。その結果、腸内細菌は希少糖によるマラリア原虫発達阻害効果には関与しないことが示唆された。
ハマダラカ雌成虫の中腸特異的に発現するアミノペプチダーゼNのノックアウト系統でみられた雌の産卵数低下のメカニズムについて検討した。中腸組織切片標本を作製し観察を行ったが、本遺伝子は血球の分解に関与しないと考えられた。
また、サシチョウバエにおけるlarval RNAi法の確立も行いその効果が確認できた。本法は成虫初期から吸血や病原体感染に関わる中腸遺伝子などの機能解析への応用が期待できる。
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| 今後の研究の推進方策 |
1．ハマダラカにおけるマラリア原虫感染阻害分子の同定：今年度までに絞り込んだ分子を蚊で効率よくノックダウンする条件を確立する。遺伝子ノックダウン蚊にマラリア原虫を感染させ、原虫の発育がどのように促進されるか検討する。
2．希少糖によるマラリア原虫発育阻害機構の解明：これまでの研究で、希少糖投与によって蚊の腸内細菌は大きな影響を受けないことが分かった。現在、希少糖投与で発現変動する遺伝子を解析しており、いくつかの分子に注目している。その分子の阻害剤や遺伝子ノックダウンによって、ハマダラカ体内でのマラリア原虫の発育にどのような影響を及ぼすか検討する。
3．サシチョウバエの病原体伝播に関わる中腸分子の探索：サシチョウバエにおいては遺伝子ノックダウンや遺伝子改変技術は確立されていない。現在検討中であるが、今後は、各発育段階に遺伝子を注入し、効率よく発現抑制や遺伝子改変ができる条件を検討する。さらにこの系を用いて、サシチョウバエ体内でのリーシュマニア原虫発育の分子機構を解明したい。
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