| 研究課題/領域番号 |
20H03167
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分42030:動物生命科学関連
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| 研究機関 | 東京大学 (2021-2023)
生理学研究所 (2020) |
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研究代表者 |
小林 俊寛 東京大学, 医科学研究所, 特任准教授 (20587414)
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| 研究分担者 |
長嶋 比呂志 明治大学, 農学部, 専任教授 (50318664)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
17,420千円 (直接経費: 13,400千円、間接経費: 4,020千円)
2023年度: 4,810千円 (直接経費: 3,700千円、間接経費: 1,110千円)
2022年度: 4,810千円 (直接経費: 3,700千円、間接経費: 1,110千円)
2021年度: 4,810千円 (直接経費: 3,700千円、間接経費: 1,110千円)
2020年度: 2,990千円 (直接経費: 2,300千円、間接経費: 690千円)
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| キーワード | 始原生殖細胞 / エピブラスト幹細胞 / ブタ / 多能性幹細胞 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
卵子・精子といったすべての生殖細胞は、受精卵から身体が作られる発生過程において、少数の始原生殖細胞から生じる。その発生メカニズムの解明は、不妊症や生殖腺を由来とする発癌の原因究明に繋がる。しかし、ヒトの始原生殖細胞は妊娠初期の胚で生じるため、直接的な解析が困難である。そこで本研究では、初期胚の特徴がマウスよりもヒトに近いブタを用い、幹細胞とその遺伝子操作を駆使しそのメカニズムを明らかにする。
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| 研究実績の概要 |
NANOS3-tdTomato クローン胚の作製
NANOS3-tdTomato ブタエピブラスト幹細胞の核をドナーとし、ブタ未受精卵へ体細胞核移植を行い、エピブラスト幹細胞の遺伝子型を持ったクローン胚作製を行った。ドナー細胞核として、細胞周期などの最適な条件を予備実験により検討した後、in vitro で胚盤胞形成率の評価、さらには子宮移植後の胚発生能評価を行った。クローン胚の解析は、顕著な数のPGC が生殖巣で見られる胎生26-30 日目に行い、生殖巣におけるNANOS3-tdTomato の発現を蛍光観察した。その結果、期待していた通り NANOS3-tTomato の発現は生殖巣のみで認められ、免疫染色による始原生殖細胞マーカー発現の確認により、それらレポーターが始原生殖細胞特異的に発現していることを明らかにした。以上、エピブラスト幹細胞の樹立およびそれらの遺伝子改変およびそれを元にしたクローン胎児の作製までを論文として報告した (Kinoshita, Kobayashi et al., Development (2021))。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
計画していた通り、ブタエピブラスト幹細胞をドナーとした核移植にクローンブタ胎児の作製に成功し、本研究課題の根幹をなす基盤技術を確立できた。また始原生殖細胞を特異的に可視化できる NANOS3-tdTomato レポーターによりブタ始原生殖細胞を追跡および純化可能になったことから、本課題で進めるブタ始原生殖細胞における遺伝子機能解析において重要なツールが完成した。以上より、計画した通り概ね順調に進展していると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
研究(1) NANOS3-tdTomato を指標とした in vitro PGC 分化誘導の最適化
NANOS3-tdTomato ブタエピブラスト幹細胞を用いて、tdTomato の発現を指標に in vitro PGC の分化誘導条件の最適化を進める。
研究(2) NANOS3-tdTomato クローン個体の解析
前年度までに NANOS3-tdTomato ブタエピブラスト幹細胞由来のクローン胚および、そこからクローン個体の作製に成功した。そこで本年度は作製された個体およびそれら由来の胎児における NANOS3-tdTomato 発現の解析を進める。
研究(3)ブタ－ヒトに共通して PGC 特異的に発現する遺伝子の同定
研究 2 のクローン胎児において NANOS3-tdTomato の蛍光を指標にブタ PGC をセルソーターで純化・分取し、次世代シーケンサーによりトランスクリプトーム解析を行う。得られたトランスクリプトームよりブタ PGC の遺伝子プロファイルを明らかにする。またそのデータをすでに報告されている マウスおよびヒト PGC のデータと比較し (Tang et al., Cell (2015))、ブタ－ヒト PGC で保存性がある且つ特異的な遺伝子の同定を行う。
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