miRNAの生細胞内検出を指向した化学反応プローブの開発

• 研究課題/領域番号: 20K05563
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 基金
• 応募区分: 一般
• 審査区分: 小区分34020:分析化学関連
• 研究機関: 岐阜大学
• 研究代表者: 柴田 綾 岐阜大学, 工学部, 助教 (50462693)
• 研究期間 (年度): 2020-04-01 – 2024-03-31
• 研究課題ステータス: 完了 (2023年度)
• 配分額: 4,420千円 (直接経費: 3,400千円、間接経費: 1,020千円); 2022年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円); 2021年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円); 2020年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
• キーワード: 遺伝子検出

研究開始時の研究の概要

miRNAは組織または時期特異的に多数のmRNAを制御することで、細胞増殖・アポトーシス・分化などに深く関与している。そのため、生きた細胞内でmiRNAの挙動を調べることは生命現象を理解するうえで重要である。しかし、生細胞内でのmiRNAイメージングの報告はこれまでのところごく少数に限られ、確立した方法がないのが現状であることから、実用的なプローブの開発が望まれている。本研究では、様々な分子を簡便に連結できるClick反応と標的遺伝子を鋳型とする芳香族求核置換反応を組み合わせることでマルチカラー化を指向した分子移動型miRNA検出プローブの開発を目指す。

研究実績の概要

生細胞内の遺伝子検出法として標的核酸を鋳型とした化学反応プローブがある。この遺伝子検出法の利点は標的核酸を鋳型とした反応サイクルを回すことで、シグナルを増幅することができる点にある。しかし、これらのプローブの多くは蛍光基質の構造変化をシグナル発生の鍵としているため、使用できる蛍光波長に制限がある。
本研究では、生細胞内での遺伝子検出が実用可能なプローブの構築を目指し、芳香族求核置換反応を利用した検出プローブの高いシグナル増幅能を維持したまま、クリック反応を利用したポスト修飾により、プローブの簡便な多色化を試みた。本年度は前年度に引き続き、クリック反応の条件の検討を行った。銅イオンの添加量などを検討した結果、クマリン色素とのクリック反応の進行は確認できたが、収量の点で未だ問題がある。プローブの反応条件の再検討を行い、2.5 nMテンプレート存在下で有意な蛍光シグナルを検出できた。