CCN２の転写因子様機能を介した線維症のキープレイヤー筋線維芽細胞分化機構の解明

• 研究課題/領域番号: 20K09889
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 基金
• 応募区分: 一般
• 審査区分: 小区分57010:常態系口腔科学関連
• 研究機関: 岡山大学
• 研究代表者: 西田 崇 岡山大学, 医歯薬学域, 准教授 (30322233)
• 研究分担者: 滝川 正春 岡山大学, 医歯薬学域, 教授 (20112063) ; 久保田 聡 岡山大学, 医歯薬学域, 教授 (90221936) ; 服部 高子 岡山大学, 医歯薬学域, 助教 (00228488) ; 青山 絵理子 岡山大学, 医歯薬学域, 助教 (10432650) ; 高江洲 かずみ (河田かずみ) 岡山大学, 医歯薬学域, 助教 (10457228)
• 研究期間 (年度): 2020-04-01 – 2024-03-31
• 研究課題ステータス: 交付 (2022年度)
• 配分額: 4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円); 2022年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円); 2021年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円); 2020年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
• キーワード: 線維化 / CCN2 / PU.1 / 筋線維芽細胞 / イントラクリン作用 / 線維症 / 筋線維芽細胞分化 / 核内移行

研究開始時の研究の概要

線維性疾患は組織内にコラーゲンが過剰に沈着し、正常な組織機能が損なわれる疾患である。近年、線維化のキープレイヤーとして筋線維芽細胞が注目されているが、その分化機構は未だ不明である。これまで、細胞外に分泌されたCCN2がオートクリン/パラクリン作用によって、筋線維芽細胞への分化を促進すると考えられてきたが、抗CCN2抗体による筋線維芽細胞への分化阻害は認められなかった。本研究は、細胞核内に存在するCCN2が転写制御因子として筋線維芽細胞への分化に影響を及ぼすことを検証し、線維性疾患の発症機序とそれに対する新規治療薬の開発を目指す。

研究実績の概要

線維症の増悪に関わる筋線維芽細胞は線維芽細胞から分化すると考えられているが、その分化メカニズムは未だ不明である。本研究課題の目的は、線維芽細胞から筋線維芽細胞への分化にCellular communication network factor 2 (CCN2)がどの様に関わっているを明らかにすることであり、これまで、核内に移行したCCN2が転写共役因子としてCCN2自体及び筋線維芽細胞分化のmaster regulatorであるPU.1の発現制御に関与する可能性を示した。今回、これらの知見の論文化に向けて、さらに詳細に以下のことを検討した。
1.シグナルペプチドを欠失させたCcn2のN末にFlag-Tagを付加したFlag-Ccn2あるいは完全長のCcn2のC末にHA-Tagを付加したCcn2-HAのそれぞれの発現プラスミドをNIH3T3細胞に遺伝子導入した後、細胞質画分と核画分に厳密に分離し、各Tag抗体でWestern blot解析を行った結果、Ccn2-HAを導入した細胞でのみ核画分にシグナルを認めた。
2.Ccn2-HAを遺伝子導入したNIH3T3細胞の核画分に抗YAP抗体を加え免疫沈降を行った後、抗HA抗体でWestern blot解析を行うと、HAのバンドが検出され、YAPとCCN2の結合が示唆された。
3.Ccn2-HAを遺伝子導入したNIH3T3細胞のゲノムDNAを抽出後、抗CCN2抗体で免疫沈降し、CCN2及びPU.1のプロモーター領域のプライマーを用いてPCRを行った結果、CCN2及びPU.1のプライマーによってDNA断片の増幅が検出された。
4.Ccn2-HAを遺伝子導入したNIH3T3細胞の核画分とCcn2プロモーター領域部で作成したDNAプローブによるゲルシフトアッセイによって、核画分タンパク質とDNAプローブとの結合が示された。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

令和4年度は、本研究課題で得られた知見を論文として発表しなければならなかったが、まだそれができていない。しかし、令和4年度では、これまで得られた結果の確認と精査、図の作成等が概ねできたので、論文を書くための準備はできている。従って、現在までの進捗状況を(3)のやや遅れていると判断した。

今後の研究の推進方策

令和4年度は、これまでの実験結果の確認と実験データのブラッシュアップに費やした。概ね、論文の図として用いることができるデータを得ることができたため、令和5年度は当該研究課題に関する論文を作成し、英文雑誌に投稿する予定である。

研究成果

• [国際共同研究] International CCN Society(フランス)
• [雑誌論文] Novel cell biological assays for measuring bone remodeling activities of CCN proteins. (2023)
  • 著者名/発表者名: Nishida T, Kubota S, Takigawa M
  • 雑誌名: Methods Mol Biol. 巻: 2582 ページ: 255-268
  • DOI: 10.1007/978-1-0716-2744-0_17
  • ISBN: 9781071627433, 9781071627440
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Do not overwork: cellular communication network factor 3 for life in cartilage. (2023)
  • 著者名/発表者名: Kubota S, Kawaki H, Perbal B, Takigawa M, Kawata K, Hattori T, Nishida T.
  • 雑誌名: J Cell Commun Signal. 巻: Feb 6. 号: 2 ページ: 353-359
  • DOI: 10.1007/s12079-023-00723-4
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Molecular and Genetic Interactions between CCN2 and CCN3 behind Their Yin-Yang Collaboration. (2022)
  • 著者名/発表者名: Kubota S, Kawata K, Hattori T, Nishida T.
  • 雑誌名: Int J Mol Sci. 巻: 24;23(11) 号: 11 ページ: 5887-5887
  • DOI: 10.3390/ijms23115887
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Bipartite regulation of cellular communication network factor 2 and fibroblast growth factor 1 genes by fibroblast growth factor 1 through histone deacetylase 1 and fork head box protein A1 (2021)
  • 著者名/発表者名: Elseoudi Abdellatif、Nishida Takashi、Mizukawa Tomomi、Hattori Takako、Kawata Kazumi、Taha Eman A.、Takigawa Masaharu、Kubota Satoshi
  • 雑誌名: Journal of Cell Communication and Signaling 巻: 15 号: 1 ページ: 81-91
  • DOI: 10.1007/s12079-020-00600-4
  • NAID: 120007182886
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] RFX1‐mediated CCN3 induction that may support chondrocyte survival under starved conditions (2021)
  • 著者名/発表者名: Mizukawa Tomomi、Nishida Takashi、Akashi Sho、Kawata Kazumi、Kikuchi Sumire、Kawaki Harumi、Takigawa Masaharu、Kamioka Hiroshi、Kubota Satoshi
  • 雑誌名: Journal of Cellular Physiology 巻: in press 号: 10 ページ: 6884-6896
  • DOI: 10.1002/jcp.30348
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Effect of Angiotensin II on Chondrocyte Degeneration and Protection via Differential Usage of Angiotensin II Receptors (2021)
  • 著者名/発表者名: Nishida Takashi、Akashi Sho、Takigawa Masaharu、Kubota Satoshi
  • 雑誌名: International Journal of Molecular Sciences 巻: 22 号: 17 ページ: 9204-9204
  • DOI: 10.3390/ijms22179204
  • NAID: 120007147372
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Cellular communication network factor 3 in cartilage development and maintenance (2021)
  • 著者名/発表者名: Kubota Satoshi、Kawaki Harumi、Perbal Bernard、Kawata Kazumi、Hattori Takako、Nishida Takashi
  • 雑誌名: Journal of Cell Communication and Signaling 巻: 15 号: 4 ページ: 533-543
  • DOI: 10.1007/s12079-021-00629-z
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Suppression of adipocyte differentiation by low-intensity pulsed ultrasound via inhibition of insulin signaling and promotion of CCN family protein 2 (2020)
  • 著者名/発表者名: Nishida T, Nagao Y, Hashitani S, Yamanaka N, Takigawa M, Kubota S
  • 雑誌名: Journal of Cellular Biochemistry 巻: - 号: 12 ページ: 29680-29680
  • DOI: 10.1002/jcb.29680
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Roles of Interaction between CCN2 and Rab14 in Aggrecan Production by Chondrocytes. (2020)
  • 著者名/発表者名: Hoshijima M, Hattori T, Aoyama E, Nishida T, Kubota S, Kamioka H, Takigawa M.
  • 雑誌名: International Journal of Molecular 巻: 21 号: 8 ページ: 2769-2769
  • DOI: 10.3390/ijms21082769
  • NAID: 120006862789
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Regulation of cellular communication network factor 2 (CCN2) in breast cancer cells via the cell-type dependent interplay between CCN2 and glycolysis (2020)
  • 著者名/発表者名: Sho Akashi, Takashi Nishida, Tomomi Mizukawa, Kazumi Kawata, Masaharu Takigawa, Seiji Iida, Satoshi Kubota
  • 雑誌名: J Oral Biosci . 巻: 62 号: 3 ページ: 280-288
  • DOI: 10.1016/j.job.2020.07.001
  • NAID: 120007147394
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Retrotransposons manipulating mammalian skeletal development in chondrocytes (2020)
  • 著者名/発表者名: Kubota S, Ishikawa T, Kawata K, Hattori T, Nishida T
  • 雑誌名: International Journal of Molecular Sciences 巻: 21 号: 5 ページ: 1564-1564
  • DOI: 10.3390/ijms21051564
  • NAID: 120006840781
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Roles of CCN2 as a mechano-sensing regulator of chondrocyte differentiation. (2020)
  • 著者名/発表者名: Nishida, T., Kubota, S.
  • 雑誌名: Jpn. Dent. Sci. Rev. 巻: 56 ページ: 119-126
  • NAID: 120007004837
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] 軟骨細胞におけるCCN2由来環状RNAの探索とその機能 (2023)
  • 著者名/発表者名: 加藤壮真、河田かずみ、水川朋美、西田 崇、久保田聡
  • 学会等名: 第35回日本軟骨代謝学会
• [学会発表] メトホルミンによる非コードRNA誘導と軟骨細胞分化促進作用 (2022)
  • 著者名/発表者名: 近藤 星、服部高子、桑原実穂、Fu Shanqi、西田 崇、薬師寺翔太、吉岡洋祐、森谷徳文、 飯田征二、滝川正春、久保田聡
  • 学会等名: 第34回日本軟骨代謝学会
• [学会発表] 軟骨細胞における転写因子RFX1を介したCCN3の発現制御機構とその役割 (2022)
  • 著者名/発表者名: 水川朋美、西田 崇、明石 翔、河田かずみ、菊池 菫、川木晴美、滝川正春、上岡 寛、久保田聡
  • 学会等名: 第34回日本軟骨代謝学会
• [学会発表] CCN6のBMP2とRANKLとの結合を介したEMT及び破骨細胞形成に対する抑制作用 (2022)
  • 著者名/発表者名: 芳地浩彰、西田 崇、滝川正春、久保田聡
  • 学会等名: 第40回日本骨代謝学会
• [学会発表] メトホルミンの軟骨細胞におけるlong non-coding RNA, UCA1およびCCN2の発現制御と代謝における意義 (2022)
  • 著者名/発表者名: 近藤 星、 服部高子、桑原実穂、Fu Shanqi、西田 崇、薬師寺翔太、吉岡洋祐、森谷徳文、飯田征二、滝川正春、久保田聡
  • 学会等名: 第13回日本CCNファミリー研究会
• [学会発表] 軟骨細胞におけるCCN2由来環状RNAの発現とその機能の探索 (2022)
  • 著者名/発表者名: 加藤壮真、河田かずみ、西田 崇、水川朋美、飯田征二、久保田聡
  • 学会等名: 第13回日本CCNファミリー研究会
• [学会発表] 口腔がん細胞の上皮間葉転換に与えるCCN6の抑制作用 (2022)
  • 著者名/発表者名: 芳地浩彰、西田 崇、滝川正春、久保田聡
  • 学会等名: 第13回日本CCNファミリー研究会
• [学会発表] 線維化を制御するPU.1発現に対する核移行したCCN2の作用 (2022)
  • 著者名/発表者名: 西田 崇、滝川正春、久保田聡
  • 学会等名: 第64回 歯科基礎医学会
• [学会発表] 筋線維芽細胞分化における細胞内CCN2の作用 (2022)
  • 著者名/発表者名: 西田 崇、辰川ひなた、滝川正春、久保田聡
  • 学会等名: 第13回日本CCNファミリー研究会
• [学会発表] DO NOT OVERWORK: CCN3 FOR LIFE IN CARTILAGE (2022)
  • 著者名/発表者名: Kubota S., Kawaki, H., Perbal, B., Takigawa, M., Kawata1, K., Hattori1 T. and Nishida, T.
  • 学会等名: The 11th International Workshop on the CCN family of Genes
  • 国際学会
• [学会発表] CCN6はSmad1/5/8のリン酸化を阻害してBMP2促進性の口腔がん細胞の上皮間葉転換を抑制する (2022)
  • 著者名/発表者名: 芳地浩彰、西田 崇、滝川正春、久保田聡
  • 学会等名: 第64回 歯科基礎医学会
• [学会発表] 軟骨細胞におけるCCN2由来環状RNAの発現 (2022)
  • 著者名/発表者名: 加藤壮真、河田かずみ、西田 崇、久保田聡
  • 学会等名: 第64回 歯科基礎医学会
• [学会発表] 線維化を制御するPU.1とCCN2発現に対するCCN2のイントラクリン作用 (2022)
  • 著者名/発表者名: 西田 崇、滝川正春、久保田聡
  • 学会等名: 第95回日本生化学会
• [学会発表] 軟骨細胞におけるメトホルミンによるlong non-coding RNA, UCA1およびCCN2の発現制御 (2022)
  • 著者名/発表者名: 近藤 星、 服部高子、桑原実穂、Fu Shanqi、西田 崇、薬師寺翔太、吉岡洋祐、森谷徳文、飯田征二、滝川正春、久保田聡
  • 学会等名: 第45回日本分子生物学会
• [学会発表] 口腔がん細胞の上皮間葉転換に与えるCCN6とBMP2の作用 (2022)
  • 著者名/発表者名: 芳地浩彰、西田 崇、滝川正春、久保田聡
  • 学会等名: 第43回岡山歯学会
• [学会発表] non-coding RNAを介したメトホルミンの抗線維化作用の解析 (2021)
  • 著者名/発表者名: 近藤 星、服部高子、桑原実穂、Fu Shanqi、西田 崇、吉岡洋祐、森谷徳文、飯田征二、滝川正春、久保田聡
  • 学会等名: 第75回日本口腔科学会
• [学会発表] 軟骨細胞でのRFX1によるCCNファミリータンパク質3遺伝子制御メカニズム。 (2021)
  • 著者名/発表者名: 水川朋美、西田 崇、明石 翔、河田かずみ、菊池 菫、川木晴美、滝川正春、上岡 寛、久保田聡
  • 学会等名: 第12回日本CCNファミリー研究会
• [学会発表] メトホルミンの軟骨細胞分化促進作用におけるUCA1とCCN2の役割 (2021)
  • 著者名/発表者名: 近藤 星、服部高子、桑原実穂、Fu Shanqi、西田 崇、吉岡洋祐、森谷徳文、飯田征二、滝川正春、久保田聡
  • 学会等名: 第12回日本CCNファミリー研究会
• [学会発表] Cellular Communication Network factor 6 (CCN6)のEMT 及び破骨細胞形成に対する抑制作用 (2021)
  • 著者名/発表者名: 芳地浩彰、西田 崇、滝川正春、久保田聡
  • 学会等名: 第12回日本CCNファミリー研究会
• [学会発表] Circadian production of melatonin and ita receptor influence metabolism and rhythmic gene expression in chondrocytes. (2021)
  • 著者名/発表者名: Fu, S.、桑原美穂、内田瑶子、近藤 星、池亀美華、丸山雄介、服部淳彦、林 大智、下村侑司、高垣安紗美、西田 崇、久保田聡、服部高子
  • 学会等名: 第62回日本生化学会 中国・四国支部例会
• [学会発表] 軟骨細解糖阻害剤NaFの線維化抑制効果とCCNファミリー遺伝子の関与 (2021)
  • 著者名/発表者名: 水川朋美、西田 崇、明石 翔、堀 彩花、高柴正悟、上岡 寛、滝川正春、久保田聡
  • 学会等名: 第62回日本生化学会 中国・四国支部例会
• [学会発表] CCN6の破骨細胞形成における阻害作用。 (2021)
  • 著者名/発表者名: 西田 崇、芳地浩彰、青山絵理子、滝川正春、久保田聡
  • 学会等名: 第39回日本骨代謝学会
• [学会発表] メトホルミンのUCA1誘導および軟骨細胞分化促進作用 (2021)
  • 著者名/発表者名: 近藤 星、服部高子、桑原実穂、Fu Shanqi、西田 崇、吉岡洋祐、森谷徳文、飯田征二、滝川正春、久保田聡
  • 学会等名: 第94回日本生化学会大会
• [学会発表] 軟骨細胞におけるRFX1を介したCCN3の発現制御機構の解明 (2021)
  • 著者名/発表者名: 水川朋美、西田 崇、明石 翔、河田かずみ、菊池 菫、川木晴美、滝川正春、上岡 寛、久保田聡
  • 学会等名: 第94回日本生化学会大会
• [学会発表] フッ化ナトリウムによるCCNファミリー遺伝子制御を介した歯肉線維化抑制作用の検討 (2021)
  • 著者名/発表者名: 水川朋美、西田 崇、明石 翔、大杉綾花、大森一弘、中山真彰、高柴正悟、上岡 寛、滝川正春、久保田聡
  • 学会等名: 第42回岡山歯学会
• [学会発表] 口腔がん細胞のEMTと破骨細胞形成におけるCellular Communication Network factor 6 (CCN6)の抑制作用。 (2021)
  • 著者名/発表者名: 芳地浩彰、久保田聡、滝川正春、西田 崇:
  • 学会等名: 第42回岡山歯学会
• [学会発表] メトホルミンによるUCA1を介した軟骨保護作用の解析。 (2021)
  • 著者名/発表者名: 近藤 星、服部高子、桑原実穂、Fu Shanqi、西田 崇、薬師寺翔太、吉岡洋祐、森谷徳文、 飯田征二、滝川正春、久保田聡
  • 学会等名: 第42回岡山歯学会
• [学会発表] メトホルミンの軟骨細胞におけるUCA1誘導をともなった分化促進作用 (2021)
  • 著者名/発表者名: 近藤 星、服部高子、桑原実穂、Fu Shanqi、西田 崇、吉岡洋祐、森谷徳文、飯田征二、滝川正春、久保田聡
  • 学会等名: 第44回日本分子生物学会年会
• [学会発表] 軟骨細胞における解糖系によるCCN3遺伝子発現制御メカニズム。 (2021)
  • 著者名/発表者名: 水川朋美、西田 崇、明石 翔、上岡 寛、滝川正春、久保田聡
  • 学会等名: 第33回日本軟骨代謝学会
• [学会発表] Regulation of CCN3 gene expression by glycolytic activity in chondrocytes. (2020)
  • 著者名/発表者名: Mizukawa, T., Nishida, T., Akashi, S., Kamioka, H., Takigawa, M., Kubota, S.
  • 学会等名: The 9th International Orthodontic Congress
  • 国際学会
• [学会発表] 軟骨細胞での解糖活性によるCCN3遺伝子の発現調節。 (2020)
  • 著者名/発表者名: 水川朋美、西田 崇、明石 翔、掘 綾花、高柴正悟、上岡 寛、滝川正春、久保田聡
  • 学会等名: 第61回日本生化学会 中国・四国支部例会
• [学会発表] Effect of melatonin on rhythmic gene expression in human articular chondrocytes. (2020)
  • 著者名/発表者名: Fu, S., Kuwahara, M., Uchida, Y., Hyashi, D., Shimomura, Y., Takagaki, A., Nishida, T., Nakata, E., Furumatsu, T., Kondo, S., Maruyama, Y., Hattori, A., Kubota, S., Hattori, T.
  • 学会等名: 第93回日本生化学会大会
• [学会発表] CCN2の核移行による線維化の制御。 (2020)
  • 著者名/発表者名: 西田 崇、滝川正春、久保田聡
  • 学会等名: 第62回歯科基礎医学会
• [学会発表] フッ素イオンによるCCNファミリー遺伝子の制御を介した歯肉線維化抑制効果の検証。 (2020)
  • 著者名/発表者名: 水川朋美、西田 崇、上岡 寛、久保田聡
  • 学会等名: 第79回日本矯正歯科学会
• [学会発表] LIPUSによる脂肪細胞分化の抑制と骨芽細胞分化への影響。 (2020)
  • 著者名/発表者名: 西田 崇、滝川正春、久保田聡
  • 学会等名: 第38回日本骨代謝学会学術集会
• [学会発表] non-coding RNAを介したメトホルミンの抗線維化作用の解析。 (2020)
  • 著者名/発表者名: 近藤 星、服部高子、桑原実穂、Fu Shanqi、西田 崇、吉岡洋祐、森谷徳文、飯田征二、滝川正春、久保田聡
  • 学会等名: 第43回日本分子生物学会年会
• [備考] https://www.okayama-u.ac.jp/user/seika/index.html
• [備考] 口腔生化学分野ホームページ
  • URL: http://www.okayama-u.ac.jp/user/seika/