革新的技術による微小転移の可視化と転移初期段階の分子機構の解明

• 研究課題/領域番号: 20K17756
• 研究種目: 若手研究
• 配分区分: 基金
• 審査区分: 小区分55040:呼吸器外科学関連
• 研究機関: 自治医科大学
• 研究代表者: 柴野 智毅 自治医科大学, 医学部, 非常勤講師 (10648900)
• 研究期間 (年度): 2020-04-01 – 2024-03-31
• 研究課題ステータス: 交付 (2022年度)
• 配分額: 4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円); 2023年度: 650千円 (直接経費: 500千円、間接経費: 150千円); 2022年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円); 2021年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円); 2020年度: 780千円 (直接経費: 600千円、間接経費: 180千円)
• キーワード: 肺癌 / 微小転移 / 肺がん / 転移 / 微小環境

研究開始時の研究の概要

肺癌が予後不良な癌腫とされる所以は転移能の高さにある。たとえ早期肺癌であっても約６割の症例で同定困難な微小転移が既に存在しており術後再発の原因となっている。肺癌の予後向上に微小転移の研究は必要不可欠であるが、未だ適切な実験モデルが存在しないため臨床応用に結びつく研究成果は得られていない。
我々はこれまでの研究でヒト肺がん細胞の微小転移モデルの作成に成功した。しかしながらマウスの微小転移は生体内および組織内での確認が困難でありさらなる実験に応用塩づらい。我々は従来法よりも検出力が高いAkaBLI、および組織透明化技術を用いてマウスの生体内および組織内での微小転移の可視化を目指す。

研究実績の概要

D-Luciferinを用いた転移モデル
A549, H441, H2009, LC-2/ad, H2228をそれぞれマウスの左心室内に移植し転移モデルを作成した。A549およびH441は多臓器への転移を認めたものの、H2009, LC-2/ad, H2228はIVISにて検出可能な転移はみられなかった。後者の細胞を移植したマウスの組織標本を確認すると、ごく少数の細胞により形成された転移巣を僅かに確認することができた。これらが微小転移のモデルになり得ると考えられた。
Akalucを用いた微小転移モデルの解析
上記実験よりH2009, LC-2/ad, H2228はマウスの左心室に移植することで微小転移を形成することが判明した。しかしながら従来のD-luciferinを用いたモデルではIVISで微小転移を検出することができず、また屠殺後の組織標本でも小さな転移巣を確認することは困難であった。そのため、D-luciferinに代わる新しい人工生物発光システム（AkaBLIS）と組織透明化技術（CUBIC）を用いて微小転移を可視化する実験へと移行した。AkaLuc遺伝子に赤色蛍光タンパク質mCherryもしくはVenusの遺伝子を連結した発現ベクターを肺腺がん細胞H2009に発現させた細胞株を作成し、上記と同様に転移実験を行なった。AkaLucを用いた解析ではIVISにおいてD-Luciferinでは検出できなかった転移巣を特定することに成功した。また経時的には移植後3週目までは発光が次第に消退していくが、3週目以降は発光部位が局在化し、一定の期間定常化した後、徐々に発光が強くなる傾向がみられた。これはがんの転移形成の初期段階の経過を見ているものと考えられた。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

計画通りに進行している。

今後の研究の推進方策

in vivoにおける微小転移モデルの作成には成功した。現在はCUBIC法を用いた臓器透明化による組織学的な微小転移の可視化に向けて実験中である。またin vitroにおいてはmRNAやメタボローム解析で得られた結果を参考にし追加実験を検討中である。