ホモKOブタ個体作成のためのdouble KO細胞の標準的取得法の開発

• 研究課題/領域番号: 21580350
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 一般
• 研究分野: 応用動物科学
• 研究機関: 鹿児島大学
• 研究代表者: 佐藤 正宏 鹿児島大学, フロンティアサイエンス研究推進センター, 教授 (30287099)
• 研究分担者: 吉田 光敏 鹿児島大学, 農学部, 教授 (00174954) ; 三好 和睦 鹿児島大学, 農学部, 准教授 (70363611)
• 研究期間 (年度): 2009 – 2011
• 研究課題ステータス: 完了 (2011年度)
• 配分額: 4,940千円 (直接経費: 3,800千円、間接経費: 1,140千円); 2011年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円); 2010年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円); 2009年度: 2,080千円 (直接経費: 1,600千円、間接経費: 480千円)
• キーワード: KOブタ / ホモ / gene targeting / 薬剤耐性 / 体細胞核移植 / 胎仔性繊維芽細胞 / 遺伝子導入 / double KO / ホモKOブタ / gene targetin / ホセKOブタ

研究概要

本研究ではどんなタイプの遺伝子でもその遺伝子発現をノックアウトできるブタ細胞における汎用性の高いdouble KO細胞を作成する方法を開発することを目指した。具体的には、ヘテロKO細胞targeting vector(TV)を再度導入し、薬剤濃度を数倍高めた条件で選別する方法(repeated delivery of TV, RDTV)を用い、特定の遺伝子の発現を抑えることに成功した。

研究成果

• [雑誌論文] Successful suppression of endogenous α-1, 3-galactosyltransferase expression by RNA interference in pig embryos generated in vitro (2012)
  • 著者名/発表者名: Chi H, Shinohara M, Yokomine T, Sato M, Takao S, Yoshida M, Miyoshi K.
  • 雑誌名: J Reprod Dev 巻: 58(1) ページ: 69-76
  • NAID: 10030407205
  • 査読あり
• [雑誌論文] Determination of the Optimal Concentration of Several Selective Drugs Useful for Generating Multi-Transgenic Porcine Embryonic Fibroblasts (2012)
  • 著者名/発表者名: Sato M, Ohtsuka M, Miura H, Miyoshi K, Watanabe S.
  • 雑誌名: Reproduction in Domestic Animals/John Wiley & Sons, Inc. 巻: 47 号: 5 ページ: 759-765
  • DOI: 10.1111/j.1439-0531.2011.01964.x
  • 査読あり
• [雑誌論文] Expression analysis of a α-1,3-galactosyltransferase, an enzyme that creates xenotransplantation-related α-Gal epitope, in pig preimplantation embryos (2012)
  • 著者名/発表者名: Chi H, Sato M, Yoshida M, Miyoshi K
  • 雑誌名: Animal Science Journal 巻: 83 ページ: 88-93
  • 査読あり
• [雑誌論文] Successful suppression of endogenous α-1, 3-galactosyltransferase expression by RNA interference in pig embryos generated in vitro (2012)
  • 著者名/発表者名: Chi H, Shinohara M, Yokomine T, Sato M, Takao S, Yoshida M, Miyoshi K
  • 雑誌名: Journal of Reproduction and Developmen 巻: 58 ページ: 69-76
  • NAID: 10030407205
  • 査読あり
• [雑誌論文] Targeted transgenesis through pronuclear injection of improved vectors into in vitro fertilized eggs (2012)
  • 著者名/発表者名: Ohtsuka M, Miura H, Nakaoka H, Kimura M, Sato M, Inoko H
  • 雑誌名: Transgenic Research 巻: 21 ページ: 225-226
  • 査読あり
• [雑誌論文] Determination of the optimal concentration of several selective drugs useful for generating multi-transgenic porcine embryonic fibroblasts (2012)
  • 著者名/発表者名: Sato M, Ohtsuka M, Miura H, Miyoshi K, Watanabe S
  • 雑誌名: Reproduction in Domestic Animals 巻: (in press)
  • 査読あり
• [雑誌論文] Generation of a set of mouse STO feeder cell lines that confer resistance to several types of selective drugs (2012)
  • 著者名/発表者名: Saitoh I, Sato M, Iwase Y, Akasaka E, Yamasaki Y, Noguchi H
  • 雑誌名: Cell Medicine (Part B of Cell Transplantation) 巻: (in press)
  • 査読あり
• [雑誌論文] Targeted Toxin as a Useful Reagent for Enrichment ofα-Gal Epitope-Negative Cells Used for Somatic Cell Nuclear Transfer in Pigs (2011)
  • 著者名/発表者名: Sato M, Chi H, Miyoshi K
  • 雑誌名: Xenotransplantation(InTech Open Acess Book)
  • 査読あり
• [雑誌論文] Cultivation with untransfected fibroblasts can stimulate proliferation of a single gene-modified fibroblast derived from a Clawn miniature swine fetus (2011)
  • 著者名/発表者名: Sato M, Yoshida M, Miyoshi K, Ohtsuka M, Watanabe S
  • 雑誌名: Reproduction in Domestic Animals/John Wiley & Sons, Inc. 巻: Vol.46, No.5 ページ: 911-916
  • 査読あり
• [雑誌論文] Whole-genome amplification-based GenomiPhi for multiple genomic analysis of individual early porcine embryos (2011)
  • 著者名/発表者名: Akasaka E, Ozawa A, Mori H, Mizobe Y, Yoshida M, Miyoshi K, Sato M.
  • 雑誌名: Theriogenology/Elsevier B. V. 巻: 75(8)
  • 査読あり
• [雑誌論文] Whole-genome amplification-based GenomiPhi for multiple genomic analys is of individual early porcine embryos (2011)
  • 著者名/発表者名: Akasaka E, Ozawa A, Mori H, Mizobe Y, Yoshida M, Miyoshi K, Sato M
  • 雑誌名: Theriogenology/Elsevier B.V. 巻: 75 ページ: 1543-1549
  • 査読あり
• [雑誌論文] Cultivation with untransfected fibroblasts can stimulate proliferation of a single gene-modified fibroblast derived from a Clawn miniature swine fetus (2011)
  • 著者名/発表者名: Sato M, Yoshida M, Miyoshi K, Ohtsuka M, Watanabe S
  • 雑誌名: Reproduction in Domestic Animals 巻: 46 ページ: 911-916
  • 査読あり
• [雑誌論文] Improvement of a phiC31 integrase-based gene delivery system that confers high and continuous transgene expression (2011)
  • 著者名/発表者名: Watanabe S, Nakamura S, Sakurai T, Akasaka K, Sato M
  • 雑誌名: New Biotechnology 巻: 28 ページ: 312-319
  • 査読あり
• [雑誌論文] A novel glycosylation signal regulates transforming growth factor receptors as evidenced by endo-β-galactosidase C expression in rodent cells (2011)
  • 著者名/発表者名: Watanabe S, Misawa M, Matsuzaki T, Sakurai T, Muramatsu T, Sato M
  • 雑誌名: Glycobiology 巻: 21 ページ: 482-492
  • 査読あり
• [雑誌論文] Simple cloning strategy using GFPuv gene as positive/negative indicator (2011)
  • 著者名/発表者名: Miura H, Inoko H, Inoue I, Tanaka M, Sato M, Ohtsuka M
  • 雑誌名: Analytical Biochemistry 巻: 416 ページ: 237-239
  • 査読あり
• [雑誌論文] Innate immune system still works at diapause, a physiological state of dormancy in insects (2011)
  • 著者名/発表者名: Nakamura A, Takezawa Y, Ohnami N, Sato M, Ono C, Harada Y, Yoshida K, Kawano N, Kanai S, Miyado M, Umezawa A
  • 雑誌名: Biochemical and Biophysical Research Communication 巻: 410 ページ: 351-357
  • 査読あり
• [雑誌論文] Beta-catenin is a molecular switch that regulates transition of cell-cell adhesion to fusion (2011)
  • 著者名/発表者名: Takezawa Y, Yoshida K, Miyado K, Sato M, Nakamura A, Kawano N, Sakakibara K, Kondo T, Harada Y, Ohnami N, Kanai S, Miyado M, Saito H, Takahashi Y, Akutsu H, Umezawa A
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 1 ページ: 68-68
  • 査読あり
• [雑誌論文] Targeted toxin as a useful reagent for enrichment of α-Gal epitope-negative cells used for somatic cell nuclear transfer in pigs (2011)
  • 著者名/発表者名: Sato M, Chi H, Miyoshi K
  • 雑誌名: Xenotransplantation/In Tech
  • 査読あり
• [雑誌論文] Production of genetically modified porcine blastocysts by somatic cell nuclear transfer : preliminary results toward production of xenograft-competent miniature pigs (2010)
  • 著者名/発表者名: Himaki T, Watanabe S, Chi H, Yoshida M, Miyoshi K, Sato M.
  • 雑誌名: Journal of Reproduction and Development 巻: 56巻 ページ: 630-638
  • NAID: 10027730311
  • 査読あり
• [雑誌論文] Effects of trichostatin A on in vitro development and transgene function in somatic cell nuclear transfer embryos derived from transgenic Clawn miniature pig cells (2010)
  • 著者名/発表者名: Himaki T, Yokomine T, Sato M, Miyoshi K, Takao S, Yoshida M.
  • 雑誌名: Animal Science Journal 巻: 81巻 ページ: 558-563
  • NAID: 10027889588
  • 査読あり
• [雑誌論文] Beneficial effects of reversine on in vitro development of miniature pig somatic cell nuclear transfer embryos (2010)
  • 著者名/発表者名: Miyoshi K, Mori H, Mizobe Y, Himaki T, Yoshida M, Sato M.
  • 雑誌名: Journal of Reproduction and Development 巻: 56巻 ページ: 291-296
  • NAID: 10026324772
  • 査読あり
• [雑誌論文] Latrunculin A dramatically improves the developmental capacity of nuclear tramsfer embryos derived from gene-modified Clawn miniature pig cells (2010)
  • 著者名/発表者名: Himaki T, Mori H, Mizobe Y, Miyoshi K, Sato M, Takao S, Yoshida M.
  • 雑誌名: Cellular Reprogramming 巻: 12巻 ページ: 127-131
  • 査読あり
• [雑誌論文] Valproic acid enhances in vitro development and Oct-3/4 expression of miniature pig somatic cell nuclear transfer embryos (2010)
  • 著者名/発表者名: Miyoshi K, Mori H, Mizobe Y, Akasaka E, Ozawa A, Yoshida M, Sato M.
  • 雑誌名: Cellular Reprogramming 巻: 12巻 ページ: 67-74
  • 査読あり
• [雑誌論文] Usefulness of a non-invasive reporter system for monitoring reprogramming state in pig cells : Results of a cell fusion experiment (2010)
  • 著者名/発表者名: Ozawa A, Akasaka E, Watanabe S, Yoshida M, Miyoshi K, Sato M.
  • 雑誌名: Journal of Reproduction and Development 巻: 56巻 ページ: 363-369
  • NAID: 10026621377
  • 査読あり
• [雑誌論文] Enrichment of xenograft-competent genetically modified pig cells using a targeted toxin, isolectin BS-I-B4 conjugate (2010)
  • 著者名/発表者名: Akasaka E, Watanabe S, Himaki T, Ohtsuka M, Yoshida M, Miyoshi K, Sato M.
  • 雑誌名: Xenotransplantation 巻: 17巻 ページ: 81-89
  • 査読あり
• [雑誌論文] Effects of trichostatin A on in vitro development and transgene function in somatic cell nuclear transfer embryos derived from transgenic Clawn miniature pig cells. (2010)
  • 著者名/発表者名: Himaki T, et al.
  • 雑誌名: Animal Science Journal 巻: 81 ページ: 558-563
  • 査読あり
• [雑誌論文] Enrichment of xenograft-competent genetically modified pig cells using a targeted toxin, isolectin BS-I-B4 conjugate. (2010)
  • 著者名/発表者名: Akasaka E, et al.
  • 雑誌名: Xenotransplantation 巻: 17 ページ: 81-89
  • 査読あり
• [雑誌論文] Pronuclear injection-based mouse targeted transgenesis for reproducible and highly efficient transgene expression. (2010)
  • 著者名/発表者名: Ohtsuka M, et al.
  • 雑誌名: Nucleic Acids Res 巻: 56 ページ: 630-638
  • 査読あり
• [雑誌論文] Production of genetically modified porcine blastocysts by somatic cell nuclear transfer : Preliminary results toward production of xenograft-competent miniature pigs. (2010)
  • 著者名/発表者名: Himaki T, et al.
  • 雑誌名: J Reprod Dev 巻: 38
  • 査読あり
• [雑誌論文] Valproic acid enhances in vitro development and Oct-3/4 expression of miniature pig somatic cell nuclear transfer embryos (2010)
  • 著者名/発表者名: Miyoshi K, et al.
  • 雑誌名: Cell Reprogram 12 ページ: 67-74
  • 査読あり
• [雑誌論文] Development of a noninvasive monitoring system for evaluation of Oct-3/4 promoter status in miniature pig somatic cell nuclear transfer embryos (2009)
  • 著者名/発表者名: Miyoshi K, Mori H, Mizobe Y, Akasaka E, Ozawa A, Yoshida M, Sato M.
  • 雑誌名: Journal of Reproduction and Development 巻: 55巻 ページ: 661-669
  • NAID: 10026322831
  • 査読あり
• [雑誌論文] Development of a noninvasive monitoring system for evaluation of Oct-3/4 promoter status in miniature pig somatic cell nuclear transfer embryos (2009)
  • 著者名/発表者名: Miyoshi K, et al.
  • 雑誌名: J Reprod Dev 55 ページ: 661-669
  • NAID: 10026322831
  • 査読あり
• [雑誌論文] A novel glycosylation signal regulates transforming growth factor β receptors as evidenced by endo-β-galactosidase C expression in rodent cells.
  • 著者名/発表者名: Watanabe S, et al.
  • 雑誌名: Glycobiology 巻: (in press)
  • 査読あり
• [雑誌論文] Latrunculin A dramatically improves the developmental capacity of nuclear transfer embryos derived from gene-modified Clawn miniature pig cells
  • 著者名/発表者名: Himaki T, et al.
  • 雑誌名: Cloning Stem Cells (in press)
  • 査読あり
• [雑誌論文] Beneficial effects of reversine on in vitro development of miniaturepig somatic cell nuclear transfer embryos
  • 著者名/発表者名: Miyoshi K, et al.
  • 雑誌名: J Reprod Dev (in press)
  • 査読あり
• [雑誌論文] Enrichment of xenograft-competent genetically modified pig cells using a targeted toxin, isolectin BS-I-B4 conjugate
  • 著者名/発表者名: Akasaka E, et al.
  • 雑誌名: Xenotransplantation (in press)
  • 査読あり
• [雑誌論文] Usefulness of a non-invasive reporter system for monitoring reprogramming state in pig cells : Results of a cell fusion experiment
  • 著者名/発表者名: Ozawa A, et al.
  • 雑誌名: J Reprod Dev (in press)
  • 査読あり
• [学会発表] 異種移植関連抗原α-Galエピトープ陰性ブタ体細胞の選択的濃縮のためのtargeted toxinの有効性 (2011)
  • 著者名/発表者名: 池海英、三好和睦、佐藤正宏
  • 学会等名: 第104回日本繁殖生物学会
  • 発表場所: いわて県民情報交流センター・アイーナ(岩手県盛岡市)
  • 年月日: 2011-09-15
• [学会発表] 異種移植関連抗原α-Galエピトープ陰性ブタ体細胞の選択的濃縮のためのtargeted toxinの有効性 (2011)
  • 著者名/発表者名: 池海英、三好和睦、佐藤正宏
  • 学会等名: 第104回日本繁殖生物学会
  • 発表場所: いわて県民情報交流センター・アイーナ(岩手県)
• [学会発表] 全ゲノム増幅法による核移植ブタ胚でのgene-targeted allele検出の有効性 (2011)
  • 著者名/発表者名: 池海英、吉田光敏、三好和睦、佐藤正宏
  • 学会等名: 第58回日本実験動物学会総会
  • 発表場所: タワーホール船堀(東京都)
• [学会発表] Skt^<Cre>系統を用いたコンディショナルノックアウト法による椎間板形成の解析 (2010)
  • 著者名/発表者名: 谷河麻耶
  • 学会等名: 第33回日本分子生物学会年会/第83回日本生化学会大会合同大会
  • 発表場所: 神戸ポートアイランド(神戸市)
  • 年月日: 2010-12-07
• [学会発表] A novel glycosylation signal regulates transforming growth factor-beta receptors as evidenced by endo-beta-galactosidase C expression in rodent cells (2010)
  • 著者名/発表者名: 渡部聡
  • 学会等名: 第33回日本分子生物学会年会/第83回日本生化学会大会合同大会
  • 発表場所: 神戸ポートアイランド(神戸市)
  • 年月日: 2010-12-07
• [学会発表] A novel glycosylation signal regulates transforming growth factor-beta receptors as evidenced by endo-beta-galactosidase C expression in rodent cells (2010)
  • 著者名/発表者名: 渡部聡、三澤雅子、松崎貴、桜井敬之、村松喬、佐藤正宏
  • 学会等名: 第33回日本分子生物学会年会/第83回日本生化学会大会合同大会
  • 発表場所: 神戸ボートアイラントド(神戸市)
• [学会発表] Skt^<Cre>系統を用いたコンディショナルノックアウト法による椎間板形成の解析 (2010)
  • 著者名/発表者名: 谷河麻耶、荒木喜美、仙波圭、佐藤正宏、檜山明彦、酒井大輔、持田譲治、山村研一、阿部幸一郎
  • 学会等名: 第33回日本分子生物学会年会/第83回日本生化学会大会合同大会
  • 発表場所: 神戸ボートアイランド(神戸市)
• [学会発表] ミニブタ体細胞の in vitro 脱分化誘導の試み (2009)
  • 著者名/発表者名: 佐藤正宏
  • 学会等名: 第56回日本実験動物学会総会
  • 発表場所: 大宮ソニックシティ(埼玉県)
  • 年月日: 2009-05-15
• [学会発表] 全ゲノム増幅法を用いた核移植由来ブタ胚細胞における外来性遺伝子検出の試み (2009)
  • 著者名/発表者名: 赤坂恵理、佐藤正宏
  • 学会等名: 第56回日本実験動物学会総会
  • 発表場所: 大宮ソニックシティ(埼玉県)
• [学会発表] ミニブタ体細胞のin vitro脱分化誘導の試み (2009)
  • 著者名/発表者名: 佐藤正宏、赤坂恵理、小澤明央
  • 学会等名: 第56回日本実験動物学会総会
  • 発表場所: 大宮ソニックシティ(埼玉県)
• [備考]
  • URL: http://kuris.cc.kagoshima-u.ac.jp/
• [備考]
• [備考]
  • URL: http://kuris.cc.kagoshima-u.ac.jp
• [備考]
  • URL: http://www2.kufm.kagoshima-u.ac.jp/~mdio/list/e/e3-3/index.html
• [備考]
  • URL: http://kuris.cc.kagoshima-u.ac.jp/
• [備考]
  • URL: http://www2.kufm.kagoshima-u.ac.jp/~mdio/list/e/e3-3/index.html
• [備考]
  • URL: http://kuris.cc.kagoshima-u.ac.jp/
• [備考]
  • URL: http://www2.kufm.kagoshima-u.ac.jp/~mdio/list/e/e3-3/index.html