研究課題/領域番号 |
21H02420
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研究種目 |
基盤研究(B)
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配分区分 | 補助金 |
応募区分 | 一般 |
審査区分 |
小区分43020:構造生物化学関連
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研究機関 | 兵庫県立大学 |
研究代表者 |
柴田 直樹 兵庫県立大学, 理学研究科, 准教授 (30295753)
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研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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配分額 *注記 |
13,000千円 (直接経費: 10,000千円、間接経費: 3,000千円)
2023年度: 2,860千円 (直接経費: 2,200千円、間接経費: 660千円)
2022年度: 3,380千円 (直接経費: 2,600千円、間接経費: 780千円)
2021年度: 6,760千円 (直接経費: 5,200千円、間接経費: 1,560千円)
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キーワード | X線構造解析 / 単粒子解析 / CKAP4 / Dikkopf / モノクローナル抗体 / 構造生物学 / Wntシグナル伝達経路 / 結晶構造解析 / クライオ電子顕微鏡 / 癌 / がん / 抗体 / シグナル伝達 |
研究開始時の研究の概要 |
Dickkopf (DKK)は,細胞分化などを制御するカノニカルWntシグナルにおける細胞外因子の1つであるが,Cytoskeleton-associated protein 4 (CKAP4)にも結合し,癌細胞増殖シグナルを活性化する。DKK/CKAP4シグナルは膵癌などにおいて60%以上の患者で高発現し,予後を悪化させる。一方,腫瘍抑制効果を発揮する抗CKAP4抗体はDKK/CKAP4シグナルを抑制するが,その分子機構は未解明である。本研究ではDKK,CKAP4,抗CKAP4抗体が構築する複合体の構造解析によって,シグナル活性化や抗CKAP4抗体が抗腫瘍効果を発揮する理由を解明する。
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研究実績の概要 |
R4年度は,研究計画調書に記した4項目のうち主に以下の3項目,① CKAP4-DKK複合体の構造解析,② CKAP4細胞外領域全体の構造解析,③ CKAP4-抗体フラグメント複合体の構造解析について研究を遂行した。以下にこれまでの結果について概要を示す。 ① CKAP4とDKK cysteine rich domain (DKK_CRD1)試料をそれぞれ別々に調製したものを混合し結晶化スクリーニングキットを用いて結晶化条件の検討を行ったところ,1条件において結晶が得られた。 ② CKAP4細胞外領域(128-602)のうち,431-602の領域について新たに発現系を構築し,結晶を得ることができた。放射光施設において回折実験を行ったところ,約 4オングストローム分解能のデータを得ることに成功した。 ③ 4種類の抗CKAP4モノクローナル抗体のFabフラグメントとCKAP4細胞外領域との複合体を調製した。結晶化スクリーニングを行うために十分な量の複合体試料を得ることが困難であったため,結晶構造解析法よりも少量での構造解析が可能なクライオ電子顕微鏡による単粒子解析を目指して測定を行った。その結果,ほとんどの粒子がグリッド上で気液界面に集合していることが判明した。得られた画像データから単粒子解析を行ったが,明瞭な三次元再構成像を得ることが困難であった。二次元でのクラスタリングではCKAP4-Fab複合体と思われる像が得られたため,グリッド作成法の検討により明瞭な三次元再構成像を得ることは可能であると思われる。
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現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
①~③の各項目について,現時点における研究全体に対する達成度は以下の通りである。 ① CKAP4-DKK複合体の構造解析(60%) ② CKAP4細胞外領域全体の構造解明(80%) ③ CKAP4-抗体フラグメント複合体の構造解析 (50%) 以上を総合すると60%以上まで到達しており,全体的には概ね計画通りに進行していると判断できる。
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今後の研究の推進方策 |
①~③の各項目について,研究の進捗状況をふまえ,以下の方針で研究を進めていく。 ①当該年度中にDKK-CRD1ドメインとCKAP4細胞外領域の複合体の結晶が得られたので,放射光施設においてX線回折データ測定し,DKK-CKAP4複合体の立体構造解析を行う。一方で,得られた結晶からは中~高分解能のX線回折データを得ることが困難な場合を想定し,引き続いてクライオ電子顕微鏡による単粒子解析も並行して実施する。これによってDKKとCKAP4の相互作用について詳細を明らかにし,LRP5/6を含めた三者複合体モデルを構築する。 ②CKAP4細胞外領域の構造解析はほぼ完了したが,まだ側鎖の構造が不明な領域があるため,引き続き結晶化条件の改良に取り組む。 ③当該年度末までに4種類の抗CKAP4モノクローナル抗体のFabフラグメントとCKAP4細胞外領域との複合体を調製した。結晶化スクリーニングを行うために十分な量の複合体試料を得ることが困難なため,結晶構造解析法よりも少量での構造解析が可能なクライオ電子顕微鏡による単粒子解析を目指して測定を行った。その結果,ほとんどの粒子がグリッド上で気液界面に集合していることが判明した。得られた画像データから単粒子解析を行ったが,明瞭な三次元再構成像を得ることが困難であった。次年度は界面活性剤を用いて粒子を液相全体に分散させることにより,高分解能での三次元再構成像を得ることを目指す。
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