研究課題/領域番号 |
21H02943
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研究種目 |
基盤研究(B)
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配分区分 | 補助金 |
応募区分 | 一般 |
審査区分 |
小区分53050:皮膚科学関連
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研究機関 | 奈良県立医科大学 |
研究代表者 |
新熊 悟 奈良県立医科大学, 医学部, 准教授 (00613788)
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研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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配分額 *注記 |
17,550千円 (直接経費: 13,500千円、間接経費: 4,050千円)
2023年度: 5,070千円 (直接経費: 3,900千円、間接経費: 1,170千円)
2022年度: 5,070千円 (直接経費: 3,900千円、間接経費: 1,170千円)
2021年度: 7,410千円 (直接経費: 5,700千円、間接経費: 1,710千円)
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キーワード | 表皮水疱症 / 復帰変異モザイク / 細胞競合 / 相同組換え |
研究開始時の研究の概要 |
遺伝子治療は遺伝性皮膚疾患の根治的治療の有望な選択肢である。しかし、遺伝子治療した細胞の全身移植は、安全面やコスト面から実現困難である。もし遺伝子治療した細胞が周囲に対し優位に増殖した場合、最小限の移植で広範囲にその効果を波及することが可能になる。近年、様々な遺伝性皮膚疾患で後天的に一部の皮膚の遺伝子が正常化することが明らかになった。興味深いことに表皮水疱症の正常化部分の面積は他の疾患に比し極めて大きく、増殖優位性を獲得していることが示唆される。そこで、本研究では、遺伝子編集技術により正常化した皮膚を有する表皮水疱症モデルマウスを作製し、表皮細胞の増殖優位性の獲得機序を解明する。
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研究実績の概要 |
本研究では、表皮細胞の増殖優位性を獲得する機序を解明するため、遺伝子編集技術を応用した復帰変異モザイクを有する表皮水疱症モデルマウスを世界で初めて作製し、①増殖優位性を有する表皮幹細胞の同定や②上皮-間葉転換の役割を明らかにする。復帰変異モザイクは体細胞分裂時の相同組換えによって生じるため、複合ヘテロ接合型遺伝子変異を有するマウスを作製する必要がある。Col17遺伝子のexon2とexon3にフレームシフト変異を導入したマウスをそれぞれ作製し、これらのマウスを交配することで、それぞれのアリルのexon2とexon3にフレームシフト変異を有する複合ヘテロCol17欠損マウスの作製に成功した。複合ヘテロCol17欠損マウスの培養表皮細胞に対して、CRISPR/Cas9発現AAVベクターを用いてexon2とexon3の間で遺伝子切断したところ、一部の細胞でCol17発現量の増加が確認でき、復帰変異モザイクを誘導できた。さらにCol17を発現する表皮角化細胞を抽出し、次世代シーケンス(Pacbio)を行ったところ、一部の細胞において相同組換えが生じていることが同定できた。 また、このAAVベクターを複合ヘテロCol17欠損マウスに遺伝子導入し、生体内で復帰変異モザイクを誘導させ、復帰変異モザイクの有無について免疫組織学的解析を用いて解析をおこなったところ、一部において、復帰変異モザイクが生体内で生じていることが証明できた。
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現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
復帰変異モザイクを生体内で安定的に作製する目途が立ってきたため。
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今後の研究の推進方策 |
上記の結果を基に、以下のような研究を行う予定である。 復帰変異モザイクを誘導した際、複数の細胞にわたり復帰変異モザイクが生じる場合と、1個の細胞のみで復帰変異モザイクが生じている2パターンがあることが分かった。この陽性細胞を細胞増殖や毛包特異的なタンパク質をターゲットとした抗体を用いた免疫組織学的解析を行うことで、復帰変異モザイクが増殖する機序を明らかにする。
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