| 研究課題/領域番号 |
21H03107
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分57010:常態系口腔科学関連
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| 研究機関 | 広島大学 |
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研究代表者 |
宿南 知佐 広島大学, 医系科学研究科(歯), 教授 (60303905)
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| 研究分担者 |
隅山 健太 国立研究開発法人理化学研究所, 生命機能科学研究センター, チームリーダー (00370114)
樋口 真之輔 神戸大学, 附属学校部, 附属中等教育学校教諭 (20847131)
吉本 由紀 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 講師 (40735304)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
17,420千円 (直接経費: 13,400千円、間接経費: 4,020千円)
2023年度: 4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2022年度: 5,850千円 (直接経費: 4,500千円、間接経費: 1,350千円)
2021年度: 7,410千円 (直接経費: 5,700千円、間接経費: 1,710千円)
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| キーワード | 腱・靱帯 / Scleraxis / エンハンサー / 遺伝子改変動物 / enChIP / Sox9 / enChIP法 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
本研究では、Transgenicマウス胚と培養細胞を用いたレポーターアッセイ、ゲノム編集技術を応用したengineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation(enChIP)法、独自に作成した遺伝子改変マウスを用いた細胞系譜と表現型の解析、免疫染色と次世代シーケンスを組み合わせた新たなOmics技術であるChromatin Integration Labeling sequencing(ChIL Seq)法などを組み合わせて、分子レベルでScxを基軸とする生命現象を明らかにする。
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| 研究実績の概要 |
Scx遺伝子の下流に同定した1.97 kbのenhancer領域を、さらに分割し、ゲノム領域をhsp68のminimal promoterとTol2配列を有するLacZ reporterベクターに組み込んたベクターを受精卵にmicroinjectionし、得られたTgマウス胚のLacZ活性をX-gal染色によって解析した。その結果、343 bpのゲノム断片にenhancer活性が検出され、哺乳類、鳥類、シーラカンスまで高度に保存されているモチーフが存在することを見出した。このゲノム領域をpGL4.23に組み込み、enhancer領域に結合する候補となる転写因子の発現ベクターと共に、HEK293T細胞、ATDC5細胞、腱細胞に導入し、Dual luciferase assayを行った。また、昨年度に引き続き、enChIPによる解析も進めている。系譜解析では、ScxCre/+:RosaTomatoマウスを用いた解析によって、２週齢の脛骨では、Scxの発現履歴がある細胞は、付着している腱や靱帯に限局しているが、６週齢になると、皮質骨や一次海綿骨の一部の骨芽細胞でも観察されることを見出している。免疫染色を行うと、それらの細胞では、Runx2の発現が検出された。ScxCreERT2;RosaTomatoマウスに、肋骨でのScxの発現が検出される胎生11.5日より後に4-ヒドロキシタモキシフェンを投与して、Tomatoの発現を観察したところ、肋骨でのCreの発現を回避することが出来ることが確認出来た。Sox9CreERT2;RosaTomatoマウスでの解析では、生後、Sox9の発現する細胞が骨格筋でも検出された。Sox9発現領域でScxを欠失するSox9Cre;Scxflox/floxマウスと野生型マウスの顎関節、腱の付着部、頭蓋の縫合部の形態・組織学的変化を解析している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
Scxの腱・靱帯特異的転写制御領域の絞り込みは、Tgマウス胚を用いた解析で順調に進んでいる。絞り込んだ領域に、種間で高度に保存されているモチーフも見出されており、Scxの発現を誘導・維持する機構についての手がかりが得られている。腱・靱帯以外でのScxの発現についても、他のマーカー遺伝子の発現を調べることによって、細胞の特性が明らかになりつつある。
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| 今後の研究の推進方策 |
これまでに同定しているScxの腱・靱帯特異的転写制御領域内で見出されているモチーフの役割について、更に解析を進める。Scxの骨における機能的な役割を明らかにするとともに、Sox9発現領域でScxを欠失するコンディショナルノックアウトマウスの表現型をScx欠失マウスの表現型とも比較しながら解析する。
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