| 研究課題/領域番号 |
21H03358
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分59040:栄養学および健康科学関連
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| 研究機関 | 山口大学 |
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研究代表者 |
水上 洋一 山口大学, 大学研究推進機構, 教授 (80274158)
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| 研究分担者 |
諌山 慧士朗 山口大学, 大学研究推進機構, 助教 (30780887)
森本 幸生 国際医療福祉大学, 福岡保健医療学部, 教授 (50202362)
渡邉 健司 山口大学, 大学研究推進機構, 助教 (50711264)
大塚 正人 東海大学, 医学部, 教授 (90372945)
小林 茂樹 山口大学, 医学部, 教授(連携講座) (90397993)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
完了 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
17,290千円 (直接経費: 13,300千円、間接経費: 3,990千円)
2023年度: 6,240千円 (直接経費: 4,800千円、間接経費: 1,440千円)
2022年度: 6,240千円 (直接経費: 4,800千円、間接経費: 1,440千円)
2021年度: 4,810千円 (直接経費: 3,700千円、間接経費: 1,110千円)
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| キーワード | 拡張型心筋症 / ゲノム解析 / ゲノム編集マウス / エクソソーム / 次世代シーケンス解析 / 分泌小胞 / 全遺伝子解析 / 心筋症 / ゲノム編集 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
心臓は特定細胞での変異シグナルが心臓内に伝達されるため、半数を占める後天的な心筋症は、バイオプシーで変異遺伝子を検出することが困難である。近年、疾患組織の遺伝子状態が分泌小胞(exosome)に放出されることが明らかになった。分泌小胞の全遺伝子発現解析(exosome-NGS)に取組み15000遺伝子の検出技術を確立した。この技術で、心筋症再現マウスのexosome-NGSデータと疾患の全遺伝子発現解析から多変量解析を用いて疾患との相関を明らかにする。また、心筋症患者さんの臨床サンプルで検証し、後天的心筋症の診断技術を確立する。
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| 研究実績の概要 |
これまでに心筋症や不整脈など心臓疾患を発症することが報告されている57遺伝子の2987領域に対する独自のカスタムパネルを作製した。このマルチプレックスPCRで既知心筋症変異の57 遺伝子全領域（2987産物）98.3% をカバーする。精製したゲノム DNA50ngおよびカスタムパネル（プライマーmix）を用いてIon Ampliseq Library Preparation キットでPCR増幅およびライブラリー作製を行った。Ion S5 Sequencing 200 Kit v2及び318 チップを用いて解析を行う。リファレンスはヒトゲノム(hg19)を用いてマッピングを行った。さらにこのデータを確認するため、PCRベースでの全エクソン配列を増幅させ、次世代シーケンサーNext-seq500（現有）で全エクソン解析を行った。 次世代シーケンスデータはPartek Flow、Variant Caller、Genomics Work Bench（全て現有）を用いて解析した結果、12名の孤発性拡張型心筋症のサンプルから3種類の遺伝子で未知の遺伝子変異が検出された。研究分担者によって開発されたGONAD法を用いて、ノックインマウスを作製した。実験は発情期にあるマウスを交配させ、翌日にプラグを確認した後、プラグ確認日にチオペンタール麻酔下、背中側から卵巣を引き出し、卵管にキャピラリーを通してハイブリダイズしたtracrRNA/crRNAとCAS9タンパク質を注入する。注入直後にin vivoでの電気穿孔法(現有)で卵管内に存在している受精卵に直接ゲノム編集を行った。その結果、1種類の遺伝子で患者さんと同じ遺伝子変異を有する拡張型心筋症の再現に成功した。現在、血清におけるエクソソームを分離し、全miRNAの解析を行うと同時に薬剤を投与し拡張型心筋症の治療を検討している。
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| 現在までの達成度 (段落) |
令和5年度が最終年度であるため、記入しない。
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| 今後の研究の推進方策 |
令和5年度が最終年度であるため、記入しない。
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