| 研究課題/領域番号 |
21K05321
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分37030:ケミカルバイオロジー関連
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| 研究機関 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 |
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研究代表者 |
丹羽 一樹 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 計量標準総合センター, 主任研究員 (30443211)
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| 研究分担者 |
山崎 太一 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 計量標準総合センター, 主任研究員 (00462838)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2023年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
2022年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
2021年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
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| キーワード | 生物発光 / 量子収率 / qNMR / 分光放射計測 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
発光反応の「明るさ」を決める発光量子収率を測定するため、まず発光反応により放出される光量子数を、光放射国家計量標準にトレーサブルな測定技術により測定する。
もう一つの測定要素である発光基質の分子数については、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）およびqNMR法など、国家計量標準の開発供給技術を活用した高精度定量を行う。
以上により、発光強度が弱く光量子数の定量が難しい発光反応系、あるいは基質分子が不安定であったため基質定量が難しい発光反応系など、これまでQYの測定が行われていなかった発光反応系でのQY測定データを取得する。
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| 研究実績の概要 |
初年度において、発光基質ホタルルシフェリンの定量の前提となる基質特性評価を行い、吸湿性、安定性あるいは純度に起因する補正要因を明らかにした。
本年度は、基質の定量に必要なHPLC定量システムを構築した。基質ルシフェリンには非発光性の光学異性体があり、これを含めて定量するためにキラルカラムを用いている。これにより、HPLCにより基質定量を行いながらの発光量子収率（QY）測定の環境整備を行った。
QY測定に必要なもう一つの要素である発光測定については、定量分析の前提となる検出応答度直線性についての評価を行った。これまでに我が国の光放射計量標準にトレーサブルな標準電球により絶対分光応答度を校正した積分球式分光放射計により、発光反応により放出される光子数を測定する方法を確立していたが、本研究計画において対象としている微弱な発光と標準電球では光量が大きく異なる。そのため、検出器のリニアリティの評価が重要となる。実際に、光電子増倍管の検出では、シグナル強度が10^5程度異なると10%以上の補正が必要となることがあることが確かめられた。これに関連して、発光反応溶液の絶対発光量の測定技術を活用し、発光測定装置（ルミノメータ、プレートリーダ等）の管理に使用する微弱LED参照光源の絶対発光量の測定法を確立し、その方法について論文発表を行った。
またQY測定の対象となる発光反応系について、condensate（凝集体、コンデンセート）中での発光特性の評価を行った。その結果、顕著なQYの上昇が認められ、これについては論文発表（Chem. Comm.）を行った。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
実験室の空調故障、コロナによる出勤停止措置等による作業の遅れが影響し、HPLCによる基質の評価が遅れている。そのため当初計画において検討していたセレテラジンの優先順位を下げ、ホタルルシフェリンでの評価を進めている。
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| 今後の研究の推進方策 |
定量NMRに基づいた基質絶対量、光学純度を含めたキラルカラムHPLCによる反応追跡、絶対発光量など、必要となる測定体勢は整いつつある。今後はHPLCによる発光反応による基質量の変動を測定する実験を行う。同時に、発光反応中の絶対発光量計測を行い、これまでの「基質分子が完全に消費されるまでを定量する」方法とは異なるQY測定実験を行う。
以上により、ホタルルシフェリンの非酵素的化学発光反応など、比較的暗い発光反応のQY測定への適用を試みる。
更に、セレテラジンあるいはそのアナログの定量評価についても可能な限り試みる。
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