| 研究課題/領域番号 |
21K06446
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分46030:神経機能学関連
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| 研究機関 | 基礎生物学研究所 |
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研究代表者 |
作田 拓 基礎生物学研究所, 超階層生物学センター, 助教 (40343743)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2023年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2022年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円)
2021年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
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| キーワード | 体液恒常性 / 飲水行動制御 / 浸透圧センサー / Nax / SLC9A4 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
申請者らは終板脈管器官(OVLT)で発現するNaチャネル分子NaxとNa＋/H＋交換輸送体ファミリー分子SLC9A4が、水分摂取行動制御を担うNa+濃度センサーであることを明らかにしたが、存在が示唆されている浸透圧センサーの分子の実体は、依然として不明のままである。本研究は、申請者らの同定したOVLT特異的に発現する分子群の中から、未知の浸透圧センサー分子の実体を明らかにし、これまでの成果と合わせて浸透圧（Na+濃度を含む）上昇時の水分摂取行動制御の脳内機構の全容解明を目指す。
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| 研究実績の概要 |
脳のうち血液脳関門を欠いた感覚性脳室周囲器官（sCVOs）は、体液のNa+濃度や浸透圧のセンサーをはじめ、体液成分のモニタリングに関わる分子が特異的に発現し、生命維持に不可欠である体液恒常性維持の根幹を担っていると考えられている。最近、研究代表者らはsCVOsのうちの終板脈管器官(OVLT)のNaチャネル分子NaxとNa＋/H＋交換輸送体ファミリー分子SLC9A4が、水分摂取行動制御を担うNa+濃度センサーであることを明らかにした。しかしながら浸透圧センサーの分子の実体は、依然として不明のままである。本研究は、研究代表者らの同定したOVLT特異的に発現する分子群の中から、未知の浸透圧センサー分子の実体を明らかにすることを目的としており、これまでの成果と合わせて浸透圧（Na+濃度を含む）上昇時の水分摂取行動制御の脳内機構の全容解明を目指す。
神経細胞やグリア細胞が活性化する際には、細胞内Na+イオンやCa2+イオンの増加を伴う。そこで神経芽細胞腫細胞株Neuro 2aや神経膠腫細胞株C6に脳内浸透圧センサーの候補分子を発現させ、浸透圧の上昇に応答して細胞内Ca2+イオン濃度が増加するかをCa2+イメージングによって検討してきた。現在まで浸透圧変化によって活性が変化すると報告があるGタンパク質共役受容体群を含む多数の分子について実験を行ったが、一部有力な候補分子を同定できたものの、脳内浸透圧センサー分子の実体を明らかにするには至っていない。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
これまで浸透圧変化によって活性が変化すると報告があるGタンパク質共役受容体群を含む多数の分子について培養細胞を用いた検討を行ったが、現在までのところ脳内浸透圧センサー分子の実体を明らかにすることに成功していない。これまでの経験から、こういった分子の探索は、淡々とこなすのしかないので、今後も地道に浸透圧に応答する分子を探索していく予定である。ただ、闇雲に実験を進めるのではなく、過去の文献から候補分子に優先順位をつけ、少しでも早く目的とする分子に行き当たるように工夫していく予定である。
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| 今後の研究の推進方策 |
浸透圧上昇時の水分摂取行動制御の脳内機構の解明を目指し以下の実験を行う。まず、同定したOVLT特異的に発現する分子群の中から、未知の浸透圧センサー分子の実体を明らかにする。次に同定した浸透圧センサー分子による神経細胞活性化機構を明らかにする。
①培養細胞を用いた浸透圧応答性の解析：２０２２年度に引き続き、脳内浸透圧センサーの候補分子が浸透圧上昇に対して応答するかを確かめる実験を行う。具体的には、脳内浸透圧センサーの候補分子を神経芽細胞腫細胞株Neuro 2aや神経膠腫細胞株C6に発現させ、浸透圧上昇に応答してこれらの培養細胞が活性化するかどうか検討する。神経細胞やグリア細胞が活性化する際には、細胞内Na+イオンやCa2+イオンの増加を伴う。そこで浸透圧センサー候補分子を発現させた細胞にそれぞれのイオンの蛍光指示薬を取り込ませ、浸透圧の上昇に応答して細胞内イオン濃度が増加するかを生細胞イメージングによって検討する。
②浸透圧センサー候補分子の発現パターンの解析：スクリーニングを行った場合、実際に目的の遺伝子が得られたかどうか確認することが必須である。そこで浸透圧センサー候補について、in situハイブリダイゼーション法や免疫染色法を用いて、マウス脳における発現パターンを検証し、OVLTに特異的に発現しているかを確認する。またOVLTでの特異的発現が確認できたものについては、その発現細胞が神経細胞かグリア細胞であるかをそれぞれのマーカーとの二重染色をすることにより確認する。
③マウス個体における機能解析：少数ではあるが有力な候補分子を同定しているので、これらについてはノックアウトマウスやノックダウンを用いた解析を行う。
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