| 研究課題/領域番号 |
21K06866
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分49010:病態医化学関連
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| 研究機関 | 群馬大学 |
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研究代表者 |
松永 耕一 群馬大学, 生体調節研究所, 助教 (20570162)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2021年度)
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| 配分額 *注記 |
4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)
2023年度: 1,040千円 (直接経費: 800千円、間接経費: 240千円)
2022年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
2021年度: 1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円)
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| キーワード | Rab27 / Exophilin / 細胞接着 / 表皮水疱症 / 調節性分泌 / 皮膚細胞 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
表皮水疱症は、先天的に皮膚が脆弱で、わずかな外力で全身に水疱、びらんの形成が起こる遺伝性疾患である。最近Exophilin-5遺伝子の異常が単純型表皮水疱症を引き起こすことが報告された。Exophilin-5は調節性分泌を制御する、単量体GTPase Rab27のエフェクターであるが、機能解析が進んでいない。本研究は、なぜExophilin-5の欠損が単純型表皮水疱症を引き起こすのか、表皮細胞でのExophilin-5の役割を解明し、その破綻によって起こる表皮水疱症の病態生理を明らかにする。
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| 研究実績の概要 |
Exophilin-5の表皮細胞での役割とその分子メカニズムを解析するため、レンチウイルスを用いたshRNA発現により、安定にExophilin-5をノックダウンした表皮細胞株HaCaTを樹立した。Exophilin-5ノックダウン細胞では、細胞接着能は低下し、細胞遊走能は逆に促進することを見出した。さらにインテグリンα６β４抗体を用いた細胞染色を行い、細胞内局在を調べたところ、通常の細胞とは異なり、Exophilin-5ノックダウン細胞では、そのヘミデスモソーム局在が著しく減少していることがわかった。これらの結果から、Exophilin-5の欠損により、ヘミデスモソーム形成が阻害されることがわかった。さらにHaCaT細胞内で、Exophilin-5に特異的に結合するタンパク質の網羅的探索を行ったところ、細胞接着に関わるタンパク質が複数同定された。今年度は同定された新規結合タンパク質の解析を行った。さらにCRISPR/Cas9系を用いたExophilin-5ノックアウト細胞の樹立し、解析の結果、Exophilin-5がヘミデスモソーム形成だけでなく、他の接着装置形成についても重要な機能を有していることが明らかになった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
まずCRISPR/Cas9系を用いたExophilin-5ノックアウトHaCaT細胞を樹立した。次に新規Exophilin-5結合タンパク質群について、Exophilin-5への結合領域を調べた。様々なExophilin-5欠失変異体を細胞に発現させ、どの領域に結合タンパク質群が結合するかどうかを調べた。次に結合領域を欠失した変異Exophilin-5をノックアウト細胞に入れ戻し、解析を進めている。またExophilin-5がヘミデスモソーム結合だけでなく、たの細胞接着装置にも機能することが予想されたので、これら細胞間結合の接着因子の局在を調べた。Exophilin-5KO HaCaT細胞を観察したところ、これら細胞接着結合の形成も有意に減少していることがわかった。これらの知見から、Exophilin-5は必要な接着装置の機能発現に必要であると考えられた。
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| 今後の研究の推進方策 |
ノックアウトマウスでの皮膚切片の抗体染色や、創傷治癒アッセイを行い、in vivoにおいても、Exophilin-5がHaCaT細胞で得られた知見と同様の機能を有するかどうかを確認する。
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