マウス肝癌移植モデルを利用した肝炎沈静化後ヒト肝癌再発メカニズムの解明

• 研究課題/領域番号: 21K07990
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 基金
• 応募区分: 一般
• 審査区分: 小区分53010:消化器内科学関連
• 研究機関: 大阪公立大学 (2022); 大阪市立大学 (2021)
• 研究代表者: 田守 昭博 大阪公立大学, 大学院医学研究科, 特任教授 (30291595)
• 研究分担者: 松原 三佐子 (佐藤三佐子) 大阪公立大学, 大学院獣医学研究科, 准教授 (00635120) ; 田中 肖吾 大阪公立大学, 大学院医学研究科, 講師 (50382114)
• 研究期間 (年度): 2021-04-01 – 2024-03-31
• 研究課題ステータス: 交付 (2022年度)
• 配分額: 4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円); 2023年度: 910千円 (直接経費: 700千円、間接経費: 210千円); 2022年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円); 2021年度: 1,950千円 (直接経費: 1,500千円、間接経費: 450千円)
• キーワード: 肝細胞癌 / 再発 / 動物モデル / 肝癌再発メカニズム / マウス肝癌移植モデル

研究開始時の研究の概要

培養肝癌細胞移植マウスモデルにて癌細胞の生着に関与している因子を網羅的に探索し、その結果を基にヒト再発肝癌のメカニズムにアプローチする計画である。マウスモデルからKeyとなる因子を絞り込み、その因子の挙動をヒトサンプルにて解析する。以上の結果からヒト肝癌再発に寄与する因子についてはその働きを培養細胞を用いて明らかにしていく計画である。

研究実績の概要

本年度は臨床データベースからSub-group解析を報告した。一つは、HCV陽性肝癌例を含む1180例の予後因子を解析である。抗ウイルス治療によるHCV RNA持続陰性化例に注目して生命予後を調査した結果、腎機能低下例(eGFR≦68)、AFP高値(AFP≧0.76)、肝予備能であるALBI grade 2以上において予後不良であった。HCV RNA持続陰性化例であっても観察期間3年以内に50％以上の肝癌再発が発生しており、再発に対する根本的な対策が必要であることを再確認した。
次に全身化学療法後の肝細胞癌の再発と生命予後に及ぼす抗ウイルス効果を報告した。対象はレンバチニブ投与79例とアテゾリズマブ+ベバシズマブ併用30例である。観察期間が短期でありアテゾリズマブ+ベバシズマブ併用治療の予後に抗ウイルス効果の関与は認めなかった。レンバチニブ投与群では抗ウイルス効果の有無による再発抑止効果は認めていない。また抗ウイルス効果があった群において生命予後が不良であり、その要因について解析中である。
基礎研究では、マウス（C57BL6J）の肝臓へ直接Luciferase陽性肝癌細胞株、Hepa1-6細胞(0.25～2x10６)を注入し同所性移植モデルの作製を試みた。しかし、肝臓内の生着は成立せず腫瘍形成率は10％以下であった。そこで、Luciferase陽性Hepa1-6細胞(1x10６)を脾臓内へ注射し肝臓内に腫瘍を形成させる方法に変更した。Hepa1-6細胞は、マウス脾臓注入直後、肝臓内に96％以上（脾臓の抽出物からは3%以下のLuciferase発現を確認）移行することがわかった。そこで同モデルにて正着した肝臓内腫瘍部、非腫瘍部よりmRNAを精製しRNA-Sequencingを行い、DNA損傷に関わるPoly ADP-ribose polymerase (PARP1) binding protein (PARPBP)遺伝子が高発現していることを見出した。その結果を基にヒト肝細胞癌切除サンプルを用いてPARPBPの免疫組織染色を進めている。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

昨年度同様に新型コロナウイルス感染への対応のため新たな臨床例の新規集積は進んでいない。本年度は、データベース症例の観察研究を主体に活動を実施した。研究概要に示した成果を論文報告したが、本研究テーマである肝癌再発機序の解明には新たな臨床サンプルの集積が必要と考えている。
基礎研究に関しては研究分担者である松原が大学内の学部移動したため研究室立ち上げに時間を要した。計画していたマウス肝癌再発モデルでの再現性が確認でいないため脾臓を介した肝癌細胞注入による新たなモデルを作成した。本モデルにて肝臓内腫瘍生着率が向上し、肝癌生着に関与する分子を探索している。抽出された分子とヒト肝癌再発との関係について解析を進めている。

今後の研究の推進方策

令和５年度から研究分担者の田中が大学非常勤となるため令和４年度と同様に本研究に適格臨床サンプルの追加収集が難しい状況が推測される。そのため既にサンプルを保存管理している肝癌根治例を再評価し、登録基準を見直して研究に利用する計画である。
また同マウス肝癌腫瘍形成モデルを用いて、①　癌微小環境への免疫細胞の特徴および浸潤機構を明らかにする。②　発現誘導システムを用いてHepa1-6細胞のPARPBPの発現量を操作し腫瘍形成能の違いを観察する。また、初診で肝癌であった300例の治療前cell free (cf) DNAサンプルを対象とし、PARPBPおよびTP53、CTNNB1、TERT遺伝子に対するプローブのRT-PCRまたはDroplet digital PCRを用いて統計学的解析を行う計画である。最終年度に可能限り再発要因に迫りたい。

研究成果

• [雑誌論文] Efficacy of rechallenge transcatheter arterial chemoembolization after lenvatinib treatment for advanced hepatocellular carcinoma (2022)
  • 著者名/発表者名: Uchida‐Kobayashi Sawako、Kageyama Ken、Takemura Shigekazu、Matsumoto Kazuhiro、Odagiri Naoshi、Jogo Atsushi、Kotani Kohei、Kozuka Ritsuzo、Motoyama Hiroyuki、Kawamura Etsushi、Hagihara Atsushi、Yamamoto Akira、Fujii Hideki、Tanaka Shogo、Enomoto Masaru、Tamori Akihiro、Miki Yukio、Kubo Shoji、Kawada Norifumi
  • 雑誌名: JGH Open 巻: 6 号: 11 ページ: 754-762
  • DOI: 10.1002/jgh3.12819
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Cancer cells produce liver metastasis via gap formation in sinusoidal endothelial cells through proinflammatory paracrine mechanisms. (2022)
  • 著者名/発表者名: Huu Hoang T, Sato-Matsubara M, Yuasa H, Matsubara T, Thuy LTT, Ikenaga H, Phuong DM, Hanh NV, Hieu VN, Hoang DV, Hai H, Okina Y, Enomoto M, Tamori A, Daikoku A, Urushima H, Ikeda K, Dat NQ, Yasui Y, Shinkawa H, Kubo S, Yamagishi R, Ohtani N, Yoshizato K, Gracia-Sancho J, Kawada N.
  • 雑誌名: Sci Adv. 巻: 8(39) 号: 39 ページ: 5525-5525
  • DOI: 10.1126/sciadv.abo5525
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Soluble Immune Checkpoint Protein CD27 Is a Novel Prognostic Biomarker of Hepatocellular Carcinoma Development in Hepatitis C Virus?Sustained Virological Response Patients (2022)
  • 著者名/発表者名: Dong Minh Phuong、Thuy Le Thi Thanh、Hoang Dinh Viet、Hai Hoang、Hoang Truong Huu、Sato-Matsubara Misako、Hieu Vu Ngoc、Daikoku Atsuko、Hanh Ngo Vinh、Urushima Hayato、Dat Ninh Quoc、Uchida-Kobayashi Sawako、Enomoto Masaru、Ohtani Naoko、Tamori Akihiro、Kawada Norifumi
  • 雑誌名: The American Journal of Pathology 巻: 192 号: 10 ページ: 1379-1396
  • DOI: 10.1016/j.ajpath.2022.07.003
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Soluble programmed cell death-1 predicts hepatocellular carcinoma development during nucleoside analogue treatment. (2022)
  • 著者名/発表者名: Ritsuzo Kozuka, Masaru Enomoto, Minh Phuong Dong, Hoang Hai, Le Thi Thanh Thuy, Naoshi Odagiri, Kanako Yoshida, Kohei Kotani, Hiroyuki Motoyama, Etsushi Kawamura, Atsushi Hagihara, Hideki Fujii, Sawako Uchida-Kobayashi, Akihiro Tamori, Norifumi Kawada
  • 雑誌名: Scientific reports 巻: 12 号: 1 ページ: 105-105
  • DOI: 10.1038/s41598-021-03706-w
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Identification of microRNA-96-5p as a postoperative, prognostic microRNA predictor in non-viral hepatocellular carcinoma (2022)
  • 著者名/発表者名: Matsui T, Hamada TS, Naito Y, Nojima M, Iio E, Tamori A, Kubo S, Ide T, Kondo Y, Eguchi Y, Komori A, Morine Y, Shimada M, Utsunomiya T, Kimura K, Hiasa Y, Ochiya T, Naiki A, Takahashi S, Tanaka Y
  • 雑誌名: Hepatol Res. 巻: 52(1) 号: 1 ページ: 93-104
  • DOI: 10.1111/hepr.13674
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Direct‐acting antivirals reduce the risk of tumour progression of hepatocellular carcinoma after curative treatment (2021)
  • 著者名/発表者名: Ikenaga Hiroko、Uchida‐Kobayashi Sawako、Tamori Akihiro、Odagiri Naoshi、Yoshida Kanako、Kotani Kohei、Motoyama Hiroyuki、Kozuka Ritsuzo、Kawamura Etsushi、Hagihara Atsushi、Fujii Hideki、Enomoto Masaru、Kawada Norifumi
  • 雑誌名: Journal of Viral Hepatitis 巻: 29 号: 1 ページ: 52-59
  • DOI: 10.1111/jvh.13627
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Postoperative direct-acting antiviral treatment after liver resection in patients with hepatitis C virus-related hepatocellular carcinoma (2021)
  • 著者名/発表者名: Tanaka S, Shinkawa H, Tamori A, Takemura S, Uchida-Kobayashi S, Amano R, Kimura K, Ohira G, Nishio K, Tauchi J, Kinoshita M, Kawada N, Kubo S.
  • 雑誌名: Hepatol Res 巻: 51 号: 11 ページ: 1102-1114
  • DOI: 10.1111/hepr.13709
  • 査読あり
• [学会発表] 実臨床でのDAA治療によるHCV制御下の生命予後に寄与する因子の検討 (2022)
  • 著者名/発表者名: 小塚立蔵、田守昭博、河田則文
  • 学会等名: 日本肝臓学会大会
• [学会発表] 全身治療導入SVR肝癌の予後についての検討 (2022)
  • 著者名/発表者名: 打田佐和子、小田桐直志、武藤芳美、小谷晃平、小塚立蔵、元山宏行、川村悦史、萩原淳司、藤井英樹、榎本大、田守昭博、河田則文
  • 学会等名: 日本肝癌研究会
• [学会発表] レンバチニブ導入SVR肝癌の予後についての検討 (2022)
  • 著者名/発表者名: 打田佐和子、田守昭博、武藤芳美、小田桐直志、小谷晃平、小塚立蔵、元山宏行、川村悦史、萩原淳司、藤井英樹、榎本大、河田則文
  • 学会等名: 日本消化器病学会総会
• [学会発表] 全身治療導入肝細胞癌における背景肝と治療効果 (2021)
  • 著者名/発表者名: 打田佐和子、小田桐直志、萩原淳司、武藤芳美、小谷晃平、小塚立蔵、元山宏行、川村悦史、藤井英樹、榎本大、田守昭博、河田則文
  • 学会等名: 日本肝臓学会西部会
• [学会発表] 抗HCV治療例の臨床経過から見た成果と課題 (2021)
  • 著者名/発表者名: 田守昭博、打田佐和子、小塚立蔵、元山宏行、小谷晃平、小田桐直志、川村悦史、藤井英樹、萩原淳司、榎本 大、河田則文
  • 学会等名: 日本肝臓学会総会