腎臓オルガノイドを用いた腎線維化増悪因子の探索

• 研究課題/領域番号: 21K08223
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 基金
• 応募区分: 一般
• 審査区分: 小区分53040:腎臓内科学関連
• 研究機関: 東京医科歯科大学
• 研究代表者: 須佐 紘一郎 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 助教 (50735842)
• 研究期間 (年度): 2021-04-01 – 2024-03-31
• 研究課題ステータス: 完了 (2023年度)
• 配分額: 4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円); 2023年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円); 2022年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円); 2021年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
• キーワード: 腎臓オルガノイド / 修飾遺伝子 / 慢性腎臓病 / 線維化

研究開始時の研究の概要

腎臓オルガノイドを用いて、慢性腎臓病(CKD)の増悪因子となるmodifier geneの同定を目指す。蛍光レポーターをiPS細胞に導入して線維化領域を可視化した腎臓オルガノイドの系を構築し、NPHP1・UMODに変異を導入したオルガノイドや、各種サイトカインによって線維化を誘発すると同時に、レンチウイルス型CRISPRライブラリ(Cell 2015等)を用いて各種遺伝子をランダムに改変する。線維化が亢進した領域の細胞を解析し、改変された遺伝子を修飾遺伝子候補として同定する。本研究により腎線維化の分子機構解明を進め、新規治療法開発につなげることを目標とする。

研究実績の概要

慢性腎臓病(CKD)では原疾患によらず線維化が進行するが、その機序は未解明な点が多い。腎線維化を生じる遺伝性疾患では、同じ遺伝子変異を有していても重症度の個人差が大きいことから、線維化の重症度に強い影響を与える別の修飾遺伝子の存在が疑われる。本研究では、腎臓オルガノイドを用いた網羅的なforward geneticsによって、このような腎線維化修飾遺伝子の同定を目指している。
まず、目的の修飾遺伝子を探索するためのスクリーニング系の構築を行っている。線維化領域を可視化するためのfibronectin/α-SMA/COL1Aプロモーターで蛍光発色するレポーターを作製した。
また、修飾遺伝子はそれ単独で線維化を起こすわけではないため、何らかの因子により容易に線維化を起こすような背景を持つ「易線維化腎臓オルガノイドモデル」が必要となる。この易線維化腎臓オルガノイドモデルとして、CRISPR-Cas9システムによりNPHP1欠損iPS細胞の作製を行った(In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal, 2022)。また、別の易線維化モデルとして、各種線維化誘発サイトカインにより健常者由来腎臓オルガノイドを線維化させるモデルも作製した。
さらに、我々は野生型とNPHP1完全欠損時の蛋白・遺伝子発現を網羅的解析(プロテオーム解析・トランスクリプトーム解析)によって比較し、NPHP1と相互作用して線維化に寄与する候補蛋白・遺伝子を複数絞り込んだ。
現在、ここまでに挙がった候補が腎線維化にどのように関わっているかの解明を進めているほか、上記の腎臓オルガノイドを用いた線維化の修飾遺伝子のスクリーニングをするための条件検討について努力している。

研究成果

• [雑誌論文] ULK1-regulated AMP sensing by AMPK and its application for the treatment of chronic kidney disease. (2023)
  • 著者名/発表者名: Tomoki Yanagi, Hiroaki Kikuchi, Koh Takeuchi, Koichiro Susa, Takayasu Mori, Naohiro Takahashi, Takefumi Suzuki, Yuta Nakano, Tamami Fujiki, Yu Hara, Soichiro Suzuki, Yutaro Mori, Fumiaki Ando, Shintaro Mandai, Shinya Honda, Satoru Torii, Shigeomi Shimizu, Tatemitsu Rai, Shinichi Uchida, Eisei Sohara.
  • 雑誌名: bioRxiv 巻: 552390
  • DOI: 10.1101/2023.08.09.552390
  • オープンアクセス
• [雑誌論文] Absence of ULK1 decreases AMPK activity in the kidney, leading to chronic kidney disease progression (2023)
  • 著者名/発表者名: Tomoki Yanagi, Hiroaki Kikuchi, Koichiro Susa, Naohiro Takahashi, Naohiro Takahashi, Hiroki Bamba, Takefumi Suzuki, Yuta Nakano, Tamami Fujiki, Yutaro Mori, Fumiaki Ando, Shintaro Mandai, Takayasu Mori, Koh Takeuchi, Shinya Honda, Satoru Torii, Shigeomi Shimizu, Tatemitsu Rai, Shinichi Uchida, Eisei Sohara
  • 雑誌名: Genes to Cells 巻: 28 号: 1 ページ: 5-14
  • DOI: 10.1111/gtc.12989
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Generation of NPHP1 knockout human pluripotent stem cells by a practical biallelic gene deletion strategy using CRISPR/Cas9 and ssODN (2022)
  • 著者名/発表者名: Nakano Yuta、Susa Koichiro、Yanagi Tomoki、Hiraoka Yuichi、Suzuki Takefumi、Mori Takayasu、Ando Fumiaki、Mandai Shintaro、Fujiki Tamami、Rai Tatemitsu、Uchida Shinichi、Sohara Eisei
  • 雑誌名: In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal 巻: 58 号: 2 ページ: 85-95
  • DOI: 10.1007/s11626-022-00655-0
  • 査読あり
• [学会発表] ヒトiPS細胞を用いたネフロン癆病態モデル腎オルガノイドの作製 (2024)
  • 著者名/発表者名: 鈴木 健文
  • 学会等名: 第1回日本腎臓学会若手基礎研究フォーラム
• [学会発表] 成人期に末期腎不全に至った患者の遺伝的背景の検討 (2023)
  • 著者名/発表者名: 藤丸拓也,蘇原映誠,森崇寧,千賀宗子,萬代新太郎,中野雄太,森雄太郎,安藤史顕,須佐紘一郎,東海 林隆男,福留裕一郎,稲葉直人,北村健一郎,中西太一,木村寿宏,田村禎一,小澤潔,内田信一
  • 学会等名: 第 66 回日本腎臓学会学術総会
• [学会発表] ULK1-Regulated AMP Sensing Mechanism by AMPK Is Disrupted in CKD (2022)
  • 著者名/発表者名: Tomoki Yanagi, Hiroaki Kikuchi, Koh Takeuchi, Koichiro Susa, Naohiro Takahashi, Yuta Nakano, Fumiaki Ando, Shintaro Mandai, Takayasu Mori, Shinya Honda, Satoru Torii, Shigeomi Shimizu, Tatemitsu Rai, Shinichi Uchida, Eisei Sohara
  • 学会等名: KIDNEY WEEK 2022
  • 国際学会