腎臓オルガノイドを用いた腎線維化増悪因子の探索

• 研究課題/領域番号: 21K08223
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 基金
• 応募区分: 一般
• 審査区分: 小区分53040:腎臓内科学関連
• 研究機関: 東京医科歯科大学
• 研究代表者: 須佐 紘一郎 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 助教 (50735842)
• 研究期間 (年度): 2021-04-01 – 2024-03-31
• 研究課題ステータス: 交付 (2022年度)
• 配分額: 4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円); 2023年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円); 2022年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円); 2021年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
• キーワード: 腎臓オルガノイド / 修飾遺伝子 / 慢性腎臓病 / 線維化

研究開始時の研究の概要

腎臓オルガノイドを用いて、慢性腎臓病(CKD)の増悪因子となるmodifier geneの同定を目指す。蛍光レポーターをiPS細胞に導入して線維化領域を可視化した腎臓オルガノイドの系を構築し、NPHP1・UMODに変異を導入したオルガノイドや、各種サイトカインによって線維化を誘発すると同時に、レンチウイルス型CRISPRライブラリ(Cell 2015等)を用いて各種遺伝子をランダムに改変する。線維化が亢進した領域の細胞を解析し、改変された遺伝子を修飾遺伝子候補として同定する。本研究により腎線維化の分子機構解明を進め、新規治療法開発につなげることを目標とする。

研究実績の概要

慢性腎臓病(CKD)では原疾患によらず線維化が進行するが、その機序は未解明な点が多い。腎線維化を生じる遺伝性疾患では、同じ遺伝子変異を有していても重症度の個人差が大きいことから、線維化の重症度に強い影響を与える別の修飾遺伝子の存在が疑われる。本研究では、腎臓オルガノイドを用いた網羅的なforward geneticsによって、このような腎線維化修飾遺伝子の同定を目指している。
まず、目的の修飾遺伝子を探索するためのスクリーニング系の構築を行っている。線維化領域を可視化するためのfibronectin/α-SMA/COL1Aプロモーターで蛍光発色するレポーターを作製した。これらは一旦作製したものの、性能が不十分であることが判明し、再作製に取り組んでいる。
また、修飾遺伝子はそれ単独で線維化を起こすわけではないため、何らかの因子により容易に線維化を起こすような背景を持つ「易線維化腎臓オルガノイドモデル」が必要となる。この易線維化腎臓オルガノイドモデルとして、CRISPR-Cas9システムによりNPHP1欠損iPS細胞の作製を行った(In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal, 2022)。また、別の易線維化モデルとして、各種線維化誘発サイトカインにより健常者由来腎臓オルガノイドを線維化させるモデルも作製した。
現在、次の段階として、これらの腎臓オルガノイドを用いて線維化の修飾遺伝子をスクリーニングするための条件検討を開始している。スクリーニングに使用するFACSや、レンチウイルス型gRNAライブラリの感染効率等の条件検討を進め、候補遺伝子の絞り込みを目指す。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

研究課題の多くは予定通り進捗している状況であるが、線維化レポーターの開発の部分について予定より時間を要している。線維化レポーターとして、レンチウイルスベクターによりfibronectin/α-SMAプロモーターで蛍光発色するレポーターを作製したが、性能を検証したところ不十分であることが判明した。そのため、改良を施したレポーターをデザインし直し、現在再作製を行っている。また、I型コラーゲンプロモーターで蛍光発色するレポーターの作製も併せて進めている。
また、線維化レポーターを作製して線維化を起こして修飾遺伝子のスクリーニングを行う部分の条件検討も、レンチウイルス型gRNAの精製・感染効率やFACSの感度などの問題が浮上しており、解決のための実験方法改良に取り組んでいる。

今後の研究の推進方策

線維化修飾遺伝子候補を選定する新規スクリーニング法を開発のため、バイオリアクターを用いた実験系の拡大を考慮している。また、オルガノイドをシングルセル化する際の効率向上のため、手作業から組織破砕装置の利用への変更も検討している。線維化レポーターの性能向上も進めている。
これらの方策により良好な線維化レポーターを搭載した易線維化腎臓オルガノイドモデルに対し、線維化を亢進させるような修飾遺伝子を探索するスクリーニングを進めていく。
スクリーニングにより候補となる修飾遺伝子が絞り込めたら、その候補遺伝子が真の線維化増悪因子であるかどうかを検証する。健常者由来iPS細胞に対して候補遺伝子を改変を行い、線維化誘発刺激を加えてみて、control群と比較し確かに線維化の亢進が生じるかを確認する。

研究成果

• [雑誌論文] Absence of ULK1 decreases AMPK activity in the kidney, leading to chronic kidney disease progression (2023)
  • 著者名/発表者名: Tomoki Yanagi, Hiroaki Kikuchi, Koichiro Susa, Naohiro Takahashi, Naohiro Takahashi, Hiroki Bamba, Takefumi Suzuki, Yuta Nakano, Tamami Fujiki, Yutaro Mori, Fumiaki Ando, Shintaro Mandai, Takayasu Mori, Koh Takeuchi, Shinya Honda, Satoru Torii, Shigeomi Shimizu, Tatemitsu Rai, Shinichi Uchida, Eisei Sohara
  • 雑誌名: Genes to Cells 巻: 28 号: 1 ページ: 5-14
  • DOI: 10.1111/gtc.12989
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Generation of NPHP1 knockout human pluripotent stem cells by a practical biallelic gene deletion strategy using CRISPR/Cas9 and ssODN (2022)
  • 著者名/発表者名: Nakano Yuta、Susa Koichiro、Yanagi Tomoki、Hiraoka Yuichi、Suzuki Takefumi、Mori Takayasu、Ando Fumiaki、Mandai Shintaro、Fujiki Tamami、Rai Tatemitsu、Uchida Shinichi、Sohara Eisei
  • 雑誌名: In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal 巻: 58 号: 2 ページ: 85-95
  • DOI: 10.1007/s11626-022-00655-0
  • 査読あり
• [学会発表] ULK1-Regulated AMP Sensing Mechanism by AMPK Is Disrupted in CKD (2022)
  • 著者名/発表者名: Tomoki Yanagi, Hiroaki Kikuchi, Koh Takeuchi, Koichiro Susa, Naohiro Takahashi, Yuta Nakano, Fumiaki Ando, Shintaro Mandai, Takayasu Mori, Shinya Honda, Satoru Torii, Shigeomi Shimizu, Tatemitsu Rai, Shinichi Uchida, Eisei Sohara
  • 学会等名: KIDNEY WEEK 2022
  • 国際学会