T細胞依存性遅発型喘息反応メディエータの解明

• 研究課題/領域番号: 21K08486
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 基金
• 応募区分: 一般
• 審査区分: 小区分54020:膠原病およびアレルギー内科学関連
• 研究機関: 独立行政法人国立病院機構(相模原病院臨床研究センター)
• 研究代表者: 森 晶夫 独立行政法人国立病院機構(相模原病院臨床研究センター), 先端技術開発研究部, 部長 (80251247)
• 研究分担者: 神山 智 独立行政法人国立病院機構(相模原病院臨床研究センター), 先端技術開発研究部, 研究員 (20626783) ; 神沼 修 広島大学, 原爆放射線医科学研究所, 教授 (80342921) ; 大友 隆之 東京薬科大学, 薬学部, 講師 (90463108)
• 研究期間 (年度): 2021-04-01 – 2024-03-31
• 研究課題ステータス: 交付 (2022年度)
• 配分額: 4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円); 2023年度: 520千円 (直接経費: 400千円、間接経費: 120千円); 2022年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円); 2021年度: 2,080千円 (直接経費: 1,600千円、間接経費: 480千円)
• キーワード: 気管支喘息 / T細胞 / 遅発型喘息反応 / メディエータ

研究開始時の研究の概要

非アトピー型喘息症例の末梢血リンパ球から抗原特異的T細胞クローンを多数樹立し、ヒト培養気管支平滑筋を封入したコラーゲンゲルの収縮アッセイ系により、培養上清中の平滑筋収縮活性を検出する。ヒトおよびマウスのT細胞クローン培養上清中の収縮活性を、まずゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー等の生化学的手法により、精製、同定をめざす。T細胞由来のmRNA、培養上清タンパク質を用いてトランスクリプトーム、プロテオーム解析し、候補分子を絞り込む。さらに、マウスT細胞移入喘息モデルを活用して、in vitro、in vivoの両面から、分子レベルでの同定を進める。

研究実績の概要

2021年度には、ダニ粗抗原に応答してT細胞IL-5産生が誘導され、吸入負荷で遅発型喘息反応が認められる症例の末梢血単核球を、当該抗原で刺激し、限界希釈法により、T細胞クローンを樹立した。動物モデル樹立の目的には、卵白アルブミン（OVA）特異的T細胞受容体トランスジェニックマウスより、T細胞クローンを複数樹立し、これらのT細胞クローンを固相化抗CD3抗体で活性化し、上清中のサイトカイン産生を特異的ELISAで測定した。培養ヒトあるいはマウス気管支平滑筋細胞を、24 well plate内でコラーゲンゲルに封入し、6日間培養後に収縮活性のアッセイに用いた。マウスでは各々のT細胞クローンを無処置マウスに移入し、抗原チャレンジ後、無拘束呼吸機能解析装置（BUXCO）を用いてPenh（enhanced pause）値を、また麻酔下、レスピレータ装着下に呼吸機能測定装置（BUXCO社）を用いて、呼吸抵抗（RL）値を測定した。実験喘息モデルでの抗原特異的遅発型喘息反応（in vivo）と、in vitroでのT細胞クローン培養上清中の気管支平滑筋収縮活性の関連について解析した。活性化に伴い気管支平滑筋収縮活性を産生するT細胞クローンを複数樹立できたので、上清を大量に作成し、濃縮、保存した。収縮活性の精製を目指し、ゲル濾過、イオン交換により分画し、平滑筋収縮活性を評価した。2022年度には、平滑筋収縮活性の高いクローンと平滑筋収縮活性のないクローンとの間で、遺伝子発現解析、生化学的精製、プロテオーム解析を実施し、候補分子の絞り込みを試みた。さらに、候補分子については、リコンビナント体の作成、中和抗体実験を開始した。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

2022年度までに予定していた4項目のうち、①IgE非依存性、T細胞依存性の遅発型喘息反応のcharacterization、新規気管支平滑筋収縮物質の同定 ― 非アトピー型喘息症例末梢血Tリンパ球、T細胞クローンの培養、培養ヒト気管支平滑筋細胞のゲル内収縮実験、②生化学的精製、ジーンチップ解析、③T細胞依存性マウス気管支閉塞モデルの解析、④ 平滑筋収縮候補分子の発現、アッセイ（中和含む）、モノクローナル抗体作成、が概ね順調に進行し、最終年度への進展につながる成果が比較的順調に得られた。

今後の研究の推進方策

2021年度に開始、2022年度に継続した研究項目のうち、②、③、④ を継続する。加えて、最終年度においては、④ 平滑筋収縮候補分子の発現、アッセイ（中和含む）、モノクローナル抗体作成に重点を置いて、研究項目②、③の結果絞り込まれた候補分子について、リコンビナント体を作成し、臨床検査診断薬開発に向けたモノクローナル抗体作成を展開したい。

研究成果

• [雑誌論文] Re-evaluation of over-the-counter histamine H1-receptor antagonists based on their effects on murine models of allergen-induced nasal hyperresponsiveness (2022)
  • 著者名/発表者名: Uda, N., Ogata, S., Yamasaki, N., Miura, S., Hosomi, N., Mori, A., Goto, M., Miura, K., and Kaminuma, O.
  • 雑誌名: J. Pharm. Sciences. 巻: 150 号: 4 ページ: 275-278
  • DOI: 10.1016/j.jphs.2022.10.004
  • 査読あり
• [雑誌論文] Th17-dependent nasal hyperresponsiveness is mitigated by steroid treatment (2022)
  • 著者名/発表者名: Ueda, S., Miura, K., Kawasaki, H., Ogata, S., Yamasaki, N., Miura, S., Mori, A., and Kaminuma, O.
  • 雑誌名: Biomolecules 巻: 12 号: 5 ページ: 674-674
  • DOI: 10.3390/biom12050674
  • 査読あり
• [雑誌論文] 重症喘息のステロイド抵抗性とその制御 (2022)
  • 著者名/発表者名: 森 晶夫、神山 智、大友 暁美、山口 美也子、組谷 智恵美、岩本 圭右、矢野 光一、藤田 教寛、岩田 真紀、永山 貴紗子、劉 楷、中村 祐人、濱田 祐斗、渡井 健太郎、上出 庸介、福冨 友馬、関谷 潔史、松本 幸一郎、谷本 安、小林 信之、大友 隆之、神沼 修
  • 雑誌名: 日本薬理学雑誌 巻: 157 ページ: 293-298
• [雑誌論文] Suppressive effect of dexamethasone on murine Th9 cell-mediated nasal eosinophilic inflammation (2021)
  • 著者名/発表者名: Koyama Teidai、Miura Kento、Yamasaki Norimasa、Ogata Sawako、Ito Daiki、Saeki Mayumi、Hiroi Takachika、Mori Akio、Kaminuma Osamu
  • 雑誌名: Asia Pacific Allergy 巻: 11 号: 3 ページ: e25-e25
  • DOI: 10.5415/apallergy.2021.11.e25
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] L-type amino acid transporter 1 inhibitor suppresses murine Th2 cell-mediated bronchial hyperresponsiveness independently of eosinophil accumulation (2021)
  • 著者名/発表者名: Ito Daiki、Miura Kento、Saeki Mayumi、Yamasaki Norimasa、Ogata Sawako、Koyama Teidai、Hiroi Takachika、Mori Akio、Endou Hitoshi、Hayashi Keitaro、Kaminuma Osamu
  • 雑誌名: Asia Pacific Allergy 巻: 11 号: 3 ページ: e33-e33
  • DOI: 10.5415/apallergy.2021.11.e33
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] T cell-dependent steroid-resistant asthma is mediated by tyrosine kinases of costimulatory signal (2022)
  • 著者名/発表者名: Mori, A., Kouyama, S., Ohtomo-Abe, A., Iwamoto, K., Yano, K., Fujita, N., Iwata, M., Nagayama, K., Nakamura, Y., Hamada, Y., Watai, K., Kamide, Y., Sekiya, K., Fukutomi, Y., Ohtomo, T., Kaminuma, O.
  • 学会等名: European Academy of Allergy and Clinical Immunology Hybrid Congress 2022
  • 国際学会
• [学会発表] Control of T cell-dependent steroid-resistant asthma model by several kinase inhibitors (2022)
  • 著者名/発表者名: Mori, A., Kouyama, S., Yamaguchi, M., Ohtomo-Abe, A., Iwamoto, K., Yano, K., Fujita, N., Iwata, M., Nagayama K., Ryu, K., Nakamura, Y., Hamada, Y., Watai, K., Kamide, Y., Sekiya, K., Fukutomi, Y., Ohtomo, T., Kaminuma, O.
  • 学会等名: European Respiratory Society International Congress 2022
  • 国際学会
• [学会発表] 重症喘息のステロイド抵抗性とその制御 (2022)
  • 著者名/発表者名: 森 晶夫、神山 智、大友暁美、山口美也子、組谷千恵美、岩本圭右、矢野光一、藤田教寛、岩田真紀、永山貴紗子、劉 楷、中村祐人、濱田祐斗、渡井健太郎、上出庸介、福冨友馬、関谷潔史、松元幸一郎、谷口 安、小林信之、大友隆之、神沼 修
  • 学会等名: 第95回日本薬理学会年会 シンポジウム27 難治性ぜんそく治療への新たな挑戦
• [学会発表] アレルゲン特異的IgE測定用3次元マイクロアレイの開発続報（第3報―1）：微量検体を用いた動じた項目測定 (2022)
  • 著者名/発表者名: 白鳥宏太、中川 舞、川上和美、伊藤正照、森 晶夫
  • 学会等名: 第71回日本アレルギー学会学術大会
• [学会発表] 微量検体から多項目のアレルゲン特異的IgEを測定する3次元マイクロアレイの開発続報（第2報）：干渉試験の評価と指頭血採血による測定 (2022)
  • 著者名/発表者名: 中川 舞、白鳥宏太、川上和美、伊藤正照、森 晶夫
  • 学会等名: 第59回日本小児アレルギー学会
• [学会発表] アレルゲン特異的IgE測定用3次元マイクロアレイの開発続報（第3報―2）：ダニアレルゲンコンポーネント測定 (2022)
  • 著者名/発表者名: 中川 舞、白鳥宏太、川上和美、伊藤正照、森 晶夫
  • 学会等名: 第71回日本アレルギー学会学術大会
• [学会発表] Pharmacological characterization of T cell-induced bronchoconstriction in vivo and in vitro (2021)
  • 著者名/発表者名: Mori, A., Kouyama, S., Yamaguchi, Y., Kumitani, C., Ohtomo-Abe, A., Kawasaki, Y., Iwamoto, K., Yano, K., Iwata, M., Nagayama, K., Ryu, K., Nakamura, Y., Hamada, Y., Watai, K., Kamide, Y., Sekiya, K., Fukutomi, Y., Ohtomo, T., and Kaminuma, O.
  • 学会等名: European Academy of Allergy and Clinical Immunology Hybrid Congress 2021 (Madrid-Krakow, on line)
  • 国際学会
• [学会発表] Sublingual immunotherapy suppresses mast cell degranulation through the upregulation of thrombospondin-1 (2021)
  • 著者名/発表者名: Kaminuma, O., Kitamura, N., Gotoh, M., Okubo, K., Mori, A., and Hiroi, T.
  • 学会等名: European Academy of Allergy and Clinical Immunology Hybrid Congress 2021 (Madrid-Krakow, on line)
  • 国際学会
• [学会発表] Molecular characterization of bronchoconstriction induced by activated T cells (2021)
  • 著者名/発表者名: Kouyama, S., Yamaguchi, M., Kumitani, C., Ohtomo-Abe, A., Kawasaki, Y., Iwamoto, K., Yano, K., Iwata, M., Nagayama, K., Ryu, K., Nakamura, Y., Hamada, Y., Watai, K., Kamide, Y., Sekiya, K., Fukutomi, Ohtomo, T., Kaminuma, O, and Mori, A.
  • 学会等名: European Respiratory Society 2021 International Congress (London, on line)
  • 国際学会
• [学会発表] Possible mechanisms of T cell-induced bronchoconstriction (2021)
  • 著者名/発表者名: Mori, A., Kouyama, S., Ohtomo-Abe, A., Ryu, K., Nakamura, Y., Hamada, Y., Watai, K., Kamide, Y., Sekiya, K., Ohtomo, T., Kaminuma, O.
  • 学会等名: Asia Pacific Association of Allergy, Asthma and Clinical Immunology International Conference 2021 (Taipei, on line)
  • 国際学会
• [学会発表] T細胞依存的に発症する新しいアレルギー性皮膚炎モデル (2021)
  • 著者名/発表者名: 尾形佐和子、三浦健人、吉川日出夫、森 晶夫、廣井隆親、神沼 修
  • 学会等名: 第70回日本アレルギー学会学術大会（横浜）
• [学会発表] アレルゲン特異的IgE測定用3次元マイクロアレイの開発1（第2報）：食物アレルゲン特異的IgE抗体測定性能評価 (2021)
  • 著者名/発表者名: 若山 翔、中川 舞、川上和美、古志洋一郎、伊藤正照、森 晶夫
  • 学会等名: 第70回日本アレルギー学会学術大会（横浜）
• [学会発表] アレルゲン特異的IgE測定用3次元マイクロアレイの開発2（第2報）：吸入アレルゲン特異的IgE抗体測定性能評価 (2021)
  • 著者名/発表者名: 川上和美、中川 舞、若山 翔、古志洋一郎、伊藤正照、森 晶夫
  • 学会等名: 第70回日本アレルギー学会学術大会（横浜）
• [学会発表] Th9細胞依存的なアレルギー性炎症は標的臓器間で異なるステロイド応答性を示す (2021)
  • 著者名/発表者名: 三浦健人、佐伯真弓、古山禎大、山崎憲政、尾形佐和子、廣井隆親、森 晶夫、神沼 修
  • 学会等名: 第70回日本アレルギー学会学術大会（横浜）
• [学会発表] Th17細胞依存的ステロイド抵抗性喘息モデルに対するアミノ酸トランスポーターLAT1阻害薬の効果 (2021)
  • 著者名/発表者名: 林啓太朗、佐伯真弓、三浦健人、山崎憲政、尾形佐和子、森 晶夫、廣井隆親、遠藤 仁、神沼 修
  • 学会等名: アレルギー・好酸球研究会2021
• [学会発表] Th17細胞依存的マウス鼻粘膜炎症モデルに対するdexamethasoneの効果 (2021)
  • 著者名/発表者名: 三浦健人、上田周作、山崎憲政、尾形佐和子、川崎英利、森 晶夫、神沼 修
  • 学会等名: アレルギー・好酸球研究会2021
• [学会発表] 微量検体から多項目のアレルゲン特異的IgEを測定する3次元マイクロアレイの評価1 (2021)
  • 著者名/発表者名: 古志洋一郎、中川 舞、川上和美、伊藤正照、森 晶夫
  • 学会等名: 第58回日本小児アレルギー学会（横浜/Web開催）
• [学会発表] 微量検体から多項目のアレルゲン特異的IgEを測定する3次元マイクロアレイの評価2 (2021)
  • 著者名/発表者名: 川上和美、中川 舞、古志洋一郎、伊藤正照、森 晶夫
  • 学会等名: 第58回日本小児アレルギー学会（横浜/Web開催）