| 研究課題/領域番号 |
21K12258
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分63030:化学物質影響関連
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| 研究機関 | 金沢医科大学 |
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研究代表者 |
坂田 ひろみ 金沢医科大学, 医学部, 准教授 (50294666)
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| 研究分担者 |
八田 稔久 金沢医科大学, 医学部, 教授 (20238025)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
完了 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2023年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2022年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円)
2021年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
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| キーワード | 組織透明化 / ホールマウント染色 / 免疫組織化学 / in situ hybridization / 多重染色 / 画像解析 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
本研究では、発生毒性試験に利用可能な組織構築の定量解析法の確立を目指す。まず、より大きな標本の透明化を目指し、迅速組織透明化法（RAP）を改良し、ホールマウントおよび厚切りスライス標本における多重染色法を確立する。さらにこの手法で多重染色された標本を用い、特定領域の細胞数計測や特異的マーカー分子を発現する構造等の計測を試み、どのような指標についての解析が毒性試験に利用可能かについて検討する。その後、実際に毒性試験に利用することを想定し、発生毒性が明らかな陽性物質(エタノール、バルプロ酸など)により誘導した既知の形態学的変化が、本研究で考案した方法でも検出できるか否かを検証しする。
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| 研究実績の概要 |
本研究は、近年我々が開発した迅速組織透明化技術（RAP)を応用した多重染色法と画像解析法を確立し、化学物質の発生毒性検証のためのハイスループットスクリーニングの手法を検討することを目的とした。RAPは骨染色標本作製時の組織透明化法として開発されたが、免疫組織化学への応用が可能であることをすでに確認している。RAPによる組織透明化を多重染色に応用することを念頭に、各種染色法への適応を検討したところ、RAP固定液で透明化処理を行った後の組織でも細胞増殖の評価に用いられるEdU標識のClick反応による検出が可能であること、およびチラミドシグナル増幅法を用いた免疫組織化学への応用も可能であることを確認した。さらに、digoxigenin標識cRNAプローブ-アルカリフォスファターゼ発色系を用いたwhole-mount in situ hybridizationにおいて、発色後にRAP固定液と新たに開発した高屈折率溶媒による透明化処理を行うことで組織が高度に透明化され、組織内における遺伝子発現パターンの3次元描出への応用が可能であることを確認した。続いて、高速共焦点画像取得が可能なハイスループット細胞機能探索システムを用いた画像取得について検討した。RAPで組織透明化を施した厚切りスライス標本やホールマウント標本で各種染色を行った後、標本をゲル包埋し、本研究にて開発した高屈折率溶媒で透徹した後、ハイスループット細胞機能探索システムCV7000（横河電機）で画像取得を行ったところ、高速で深部スキャンが可能であり、広視野で撮影したＺスタック画像セットを用いることで標識構造物の3次元像を標本全体で再構築することが可能であった。。本研究で検討したRAPによる組織透明化を施した標本での各種染色法と深部イメージング法は、多重染色により標識された構造物の定量化を可能にする手法として有用である。
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