| 研究課題/領域番号 |
21K14751
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| 研究種目 |
若手研究
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| 配分区分 | 基金 |
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| 審査区分 |
小区分37030:ケミカルバイオロジー関連
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
橋谷 文貴 名古屋大学, 物質科学国際研究センター, 助教 (30846423)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
完了 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
4,680千円 (直接経費: 3,600千円、間接経費: 1,080千円)
2023年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円)
2022年度: 2,210千円 (直接経費: 1,700千円、間接経費: 510千円)
2021年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
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| キーワード | DNA光切断 / DNA二本鎖切断 / ヌクレオソーム / クロマチンリモデリング / 2’-Se nucleotide / ニトロベンジル光保護基 / 2'-Se nucleotide / H2A.X / Bromouracil / Chromatin dynamics / Photoreaction / Modified histone / DNA lesion |
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| 研究開始時の研究の概要 |
真核生物の染色体において二本鎖切断のマーカーとして挿入されるH2AXの詳細な挙動をin vitro実験にて解析する。H2AXの挙動は細胞実験から得られたものであり損傷部位への挿入メカニズムについては不明な点が多い。本研究では化学修飾を利用することで、光照射によって切断されるDNA、および挿入の検出が可能なヒストンを開発する。核抽出液存在下これらを用いてヌクレオソームを形成し、DNA光切断後のH2AXの挿入および除去を観察することでDNA損傷部位に対するH2AXの挙動とその責任タンパク質について詳しい知見を得る。
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| 研究実績の概要 |
本研究は光照射によりヌクレオソーム上のDNAに二本鎖切断を誘導し、その挙動の確認を試みるものである。二本鎖切断は致命的なDNA損傷の一つであり細胞内でこれが起こった場合、直ちにDNA複製が停止し修復系が働くことが知られている。しかし二本鎖切断部位周辺にヒストンバリアントであるH2A.Xがリン酸化されたγH2A.Xがマーカーとして集積することはわかっているものの、詳しい集積メカニズムは不明である。これはDNA修復の研究が主に細胞を用いたin vivo実験で行われているためであり、詳細なメカニズムを調べるにはin vitro実験系の構築が求められている。そこで光照射で切断を誘導できる化学修飾DNAを用意し、これを用いてヌクレオソームを再構成することで任意のタイミングで二本鎖切断を起こす実験系の確立を目指した。
光照射で切断できるDNAは2’位にセレノ基とニトロベンジル基修飾を施すことで達成した。光照射によりニトロベンジル基が外れ、活性化されたセレノ基によってDNA鎖切断が誘導される。実際の切断実験から短時間の光照射で定量的に切断反応が進行することが分かった。また元々はDNAの接着末端を形成する技術であったことから、本化学修飾を用いたプラスミド構築実験を行った。こちらに関しても光照射による鎖切断により接着末端が形成され効率的なDNA連結反応が確認できた。本修飾DNAは光照射によって任意のタイミングで二本鎖切断を起こすものである。よってin vivo実験への応用を見越して本修飾で生じた二本鎖切断が細胞内の機構によって修復されうるのかどうかをレポーターアッセイによって評価した。細胞内における鎖切断は確認できたものの、DNA切断の修復は確認できなかった。本化学修飾によって導入されたDNAの切断部位は5’リン酸化された天然の構造となる。よって修復されない原因は配列設計等にあると考えている。
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