| 研究課題/領域番号 |
21K16390
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| 研究種目 |
若手研究
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| 配分区分 | 基金 |
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| 審査区分 |
小区分55010:外科学一般および小児外科学関連
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| 研究機関 | 東京慈恵会医科大学 |
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研究代表者 |
安田 淳吾 東京慈恵会医科大学, 医学部, 助教 (90896870)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
4,550千円 (直接経費: 3,500千円、間接経費: 1,050千円)
2023年度: 1,820千円 (直接経費: 1,400千円、間接経費: 420千円)
2022年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
2021年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円)
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| キーワード | Lysosome酵素 / ミトコンドリア / オートファジー / 膵癌 / PanIN / 糖脂質代謝 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
膵臓癌患者は年々増加しており、予後は依然として不良であり、改善が望まれる。膵臓癌は乏血性の腫瘍であり、血管新生が乏しい。膵臓癌では低酸素、低栄養環境下で増殖可能なようにオートファジーが亢進し、栄養が供給されることが特徴である。膵臓癌におけるオートファジーの活性低下が発癌の一因と考えられており、オートファジーの最終段階であるLysosome酵素に注目し、本研究では、膵臓癌の前癌病変PanINにおいて、Lysosome酵素が糖脂質代謝を介して発癌・進展に関与する機序を解明する。そして、そのLysosome酵素を抑制することで革新的治療法の開発を目指す。
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| 研究実績の概要 |
膵臓癌患者は年々増加しており、医療技術の進歩にかかわらずその予後は依然として不良であり5年生存率はいまだすべての癌種のなかで不良である。またその悪性度の高さにより診断時に手術可能な症例は全体の10-20％にとどまっており、化学療法の進歩により予後の改善が望まれており、また分子標的薬の開発によりその予後の改善が望まれている。膵臓癌は乏血性の腫瘍であり、血管新生が乏しいことが広く知られている。膵臓癌では低酸素、低栄養環境下で増殖可能なようにオートファジーが亢進し、栄養が供給されることが特徴であり、膵臓癌におけるオートファジー機構は癌治療における有望な標的となっている。癌細胞はオートファジーによって異常な高分子を分解することによって細胞内環境を維持し、細胞死から逃れているという特徴がある。そのためオートファジーを阻害することで抗がん剤耐性の改善が見込める可能性があると考える。オートファジーの最終段階はLysosomeに依存した分解系であり、特定のLysosome酵素を選択的に阻害することにより、オートファジーの分解不全を誘導し、抗がん剤の効果を高める方法を着想した。本研究では酸性βグルコシダーゼ(GBA)による糖脂質代謝ネットワークを解析し、抗がん剤耐性の原因を明らかにするとともに、膵癌治療における基礎的知見を提供する。また、いまだに解明されていない抗がん剤投与下のGBAの機能を解明する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
膵臓癌細胞株と正常膵管細胞に関してGBA酵素活性を測定し、癌細胞株間での酵素活性の相違が、GBA蛋白発現量との相関を示した。またsiRNA法を用いてGBAをノックダウンし、GBA酵素活性と蛋白発現量が有意な減少を確認した。また、GBAのノックダウンにより、もともとのGBA酵素活性の大きさにかかわらず、細胞増殖抑制効果を認め、同時にアポトーシス細胞の増加、アポトーシスシグナルの増強を認めた。
膵癌株においてGBAノックダウンでの形態学的評価を行った。GBAノックダウンにより、各株で膨化したミトコンドリアの蓄積が確認され、蛍光顕微鏡下でのミトコンドリアの蓄積と、ライソソーム活性の低下も確認された。 続いて、蓄積したミトコンドリアの機能の評価のために、細胞内の活性酸素種(ROS)を評価した。フローサイトメトリーでの細胞内ROSの蓄積が確認された。ミトコンドリア内においてもROSの蓄積が確認され、ミトコンドリアの機能不全が示唆された。実際のミトコンドリア機能障害の評価目的でミトコンドリア膜電位をフローサイトメトリーの間接的な測定を行い、膜電位の低下を認め、GBAノックダウンで細胞内に蓄積したミトコンドリアは、膜電位が低下した不良ミトコンドリアであることが示された。不良ミトコンドリアの蓄積の原因の評価に、マイトファジー機構を検索した。蛍光顕微鏡において、Mtphagy Dye®を用いて、赤色蛍光を発色する蛍光法でマイトファジーを評価した。さらのその蛍光をフローサイトメトリーで定量し、GBAのノックダウンにおけるマイトファジーを評価した。フローサイトメトリーと免疫蛍光染色のいずれでも、GBAノックダウンによりマイトファジー活性が低下していた。またマイトファジーの評価のためオートファジー関連蛋白質の発現をウエスタンブロッティングで行ったところ、LC3II蛋白質の蓄積を認めた。
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| 今後の研究の推進方策 |
ここまで、GBAノックダウンにより不良ミトコンドリアが蓄積されることが明らかとなっており、さらに不良ミトコンドリアの蓄積の原因を評価することを検討している。具体的に、ミトコンドリアの選択的オートファジーであるマイトファジー機構を検索し、マイトファジーの評価でLC3II蛋白質の蓄積を認めた。つづいてはオートファジー関連タンパク質であるLC3とp62の発現量をウエスタンブロッティング法で評価する予定である。さらに今後の展望として1.GBA酵素活性の変化のある膵癌を標的として研究を進める。大腸癌ではGBA酵素活性に変化が出ない理由を合わせて検討する。2.GBAの機能解析を主眼とした実験を行う。GBAの遺伝子変異とParkinson病の関係が注目されている。ミトコンドリア機能とマイトファジーに着目し、追加の詳細な検討を行う。3.マイトファジーの低下が確認されたため、ライソソーム関連膜タンパク質であるLAMP2、マイトファジーに重要な役割を果たすユビキチンリガーゼであるPINK1/Parkinをウエスタンブロッティング法で評価する。
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