| 研究課題/領域番号 |
23K23822
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| 補助金の研究課題番号 |
22H02558 (2022-2023)
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 基金 (2024)
補助金 (2022-2023) |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分43020:構造生物化学関連
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
山下 栄樹 大阪大学, 蛋白質研究所, 准教授 (00294132)
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| 研究分担者 |
中川 敦史 大阪大学, 蛋白質研究所, 教授 (20188890)
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| 研究期間 (年度) |
2024-04-01 – 2026-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2024年度)
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| 配分額 *注記 |
17,160千円 (直接経費: 13,200千円、間接経費: 3,960千円)
2025年度: 3,770千円 (直接経費: 2,900千円、間接経費: 870千円)
2024年度: 3,510千円 (直接経費: 2,700千円、間接経費: 810千円)
2023年度: 4,940千円 (直接経費: 3,800千円、間接経費: 1,140千円)
2022年度: 4,940千円 (直接経費: 3,800千円、間接経費: 1,140千円)
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| キーワード | 立体構造解析 / 相互作用解析 / 膜蛋白質複合体 / トランスポーター / 立体構造 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
複数の抗菌剤が効かない多剤耐性緑膿菌による免疫不全患者への院内感染は、重篤な症状を引き起こすため社会的に大きな問題となっている。日和見細菌である緑膿菌が多剤耐性化する主な原因として、菌体内に進入した抗菌剤を排出する4種類の薬剤排出タンパク質複合体が深く関与している。本研究では、緑膿菌で多剤耐性の発現に関わる薬剤排出タンパク質複合体の立体構造をクライオ電子顕微鏡単粒子解析法とX線結晶構造解析法を用いて解明し、各複合体と様々な抗菌剤との相互作用様式を明らかにすることにより、複数の薬剤排出タンパク質複合体による多剤耐性化機構の理解を深めることを目的とする。
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| 研究実績の概要 |
本研究課題では、緑膿菌が持つ複数種類の薬剤排出タンパク質複合体の詳細な作動原理を明らかにするとともに、各複合体と様々な抗菌剤との相互作用様式を明らかにすることにより、緑膿菌の多剤耐性発現における各薬剤排出タンパク質複合体の役割を明確にすることを目指す。これまでに続き、１）基質である抗菌剤との相互作用解析、２）主にアミノグリコシド系抗菌剤を排出する活性型トラスポーターの構造解析を進めた。それぞれ具体的には以下のことを行った。
１）基質である抗菌剤との相互作用解析については、昨年度回折強度データが得られた抗菌剤結合型MexB結晶の構造解析を行った。予想通り結合ポケットに抗菌剤の電子密度が得られ、電子密度の周辺のアミノ酸残基から認識に重要なアミノ酸残基の候補をピックアップした。さらに5種類の抗菌剤結合型の結晶構造解析を進め、１種類の抗菌剤についてのみ抗菌剤の電子密度が確認できた。2種類の抗菌剤結合型の構造から抗菌剤認識に重要なアミノ酸残基の候補を絞り、ピックアップしたアミノ酸残基が抗菌剤の認識にどのような影響を与えるか調べるために変異体作製に取り組んだ。
２）MexYの構造解析については、昨年にクライオ電子顕微鏡画像データを取得した基質存在下キメラ体の構造解析を進めた。基質非存在下に比べて分解能の良好な構造を得られたが、基質非存在下と同様に基質結合ドメイン以外のドメインで大きな揺らぎがみられた。より安定な活性型MexY構造を得るために、新しいキメラ体のコンストラクトを作製し、精製を行った。精製した新規キメラ体MexYはこれまで用いていたキメラ体より安定であることが、動的光散乱、mass-photometoryによって確認できた。この新規キメラ体MexYのクライオ電子顕微鏡画像データを収集し、これまで以上に高い割合で粒子を拾うことができた。
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| 現在までの達成度 |
現在までの達成度
2: おおむね順調に進展している
理由
抗菌剤との相互作用解析については、各抗菌剤の解離定数や熱力学的パラメータの情報量がまだ少ないが、結晶構造解析から認識に関わるアミノ酸残基をみつけることができ、重要なアミノ酸残基同定のための変異体作製のための準備が行えた。MexYの構造解析については、新規キメラ体のクライオ電子顕微鏡画像データから膨大な粒子数が収集できた。さらに、基質存在下でのクライオ電子顕微鏡画像データの取得も成功した。今回用いた新規キメラ体の作製方法については、MexYと同様に活性型が不安定なMexDの構造解析に向けた試料調製にも有用であると考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
構造情報を元にして作製した変異体を用いて、in vivo実験による抗菌剤認識に重要なアミノ酸残基の同定を行うとともに、示差走査熱量測定や等温滴定型熱量測定などにより熱力学的なパラメータの実測も行い、定量的な相互作用の理解を進める。新規キメラ体MexYの構造解析を基質存在下及び非存在下で進め、アミノグリコシド系抗菌剤の認識部位の同定及びMexY特有の構造変化を明らかにするとともにMexYの薬剤排出機構の知見を得る。今回用いた新規キメラ体作製方法をMexDの構造解析に適用するための準備を行う。
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