界面活性剤を用いたクリプトスポリジウム高感度検出技術の開発と病原性判定への応用

• 研究課題/領域番号: 25420559
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 基金
• 応募区分: 一般
• 研究分野: 土木環境システム
• 研究機関: 静岡県立大学
• 研究代表者: 関川 貴寛 静岡県立大学, 食品栄養科学部, 助教 (20511728)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2017-03-31
• 研究課題ステータス: 完了 (2016年度)
• 配分額: 4,810千円 (直接経費: 3,700千円、間接経費: 1,110千円); 2015年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円); 2014年度: 1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円); 2013年度: 1,820千円 (直接経費: 1,400千円、間接経費: 420千円)
• キーワード: クリプトスポリジウム / 病原性原虫 / リアルタイムPCR / 界面活性剤 / 免疫磁気分離 / 核酸抽出 / オーシスト / 河川水 / 界面活性剤抽出処理 / LAMP法 / 免疫磁気ビーズ / 水道水 / PCR / LAMP / 逆転写酵素 / PCR法 / 飲料水

研究成果の概要

上水道の残留塩素などによる消毒ではクリプトスポリジウムオーシストを不活化させることができないため、オーシストは先進諸国においても集団下痢症の原因になっている。強固なオーシストからの核酸抽出工程では、凍結融解や酵素処理、核酸精製など、高額な抽出精製キットまたは煩雑な操作を必要とするのが現状である。本研究では、免疫磁気分離（IMS）と界面活性剤抽出処理（SET）を併用したIMS-SET法によるDNA検出感度の評価および検討を行った。その結果、IMS-SET法を確立し、クリプトスポリジウム遺伝子検査法の簡便・高感度化に成功した。

研究成果

• [雑誌論文] A new immunomagnetic bead separation-surfactant extraction treatment protocol for rapid and sensitive quantitative PCR-detection of Cryptosporidium parvum DNA (2017)
  • 著者名/発表者名: 関川貴寛
  • 雑誌名: Wat. Sci. Tech.: Water Suppl. 巻: 17 号: 1 ページ: 161-168
  • DOI: 10.2166/ws.2016.125
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] A new method for efficient detection of Cryptosporidium RNA by real-time reverse transcription-PCR with surfactants (2015)
  • 著者名/発表者名: 関川貴寛，戸敷浩介
  • 雑誌名: Water Science and Technology: Water Supply. 巻: 15（5） 号: 5 ページ: 1061-1068
  • DOI: 10.2166/ws.2015.063
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [学会発表] A new method for Cryptosporidium DNA detection by immunomagnetic bead separation and surfactant extraction treatment (IMS-SET) (2016)
  • 著者名/発表者名: 関川貴寛
  • 学会等名: IWA Microbial Ecology in Water Engineering & Biofilms joint specialist conference
  • 発表場所: Copenhagen, Sweden
  • 年月日: 2016-09-04
  • 国際学会
• [学会発表] 界面活性剤抽出処理を用いた環境水中のクリプトスポリジウム検出法 (2016)
  • 著者名/発表者名: 関川貴寛
  • 学会等名: 第50回日本水環境学会年会
  • 発表場所: アスティとくしま（徳島県徳島市）
  • 年月日: 2016-03-16
• [学会発表] An improved method for extracting DNA from Cryptosporidium oocysts using immunomagnetic separation and surfactant extraction treatment (2015)
  • 著者名/発表者名: 関川貴寛
  • 学会等名: 6th International Conference on Environmental Industrial and Applied Microbiology
  • 発表場所: University of Barcelona（バルセロナ，スペイン）
  • 年月日: 2015-10-28
  • 国際学会
• [学会発表] Detection of Cryptosporidium oocyst RNA by surfactant extraction treatment and RT-PCR: Inhibition of reverse transcription by SDS and its suppression using nonionic surfactants (2015)
  • 著者名/発表者名: 関川貴寛，戸敷浩介
  • 学会等名: 6th Congress of European Microbiologists
  • 発表場所: MECC Maastricht（マーストリヒト，オランダ）
  • 年月日: 2015-06-07
  • 国際学会
• [学会発表] A novel method for simple and sensitive detection of Cryptosporidium parvum by surfactant extraction treatment (SET) and quantitative reverse transcription-PCR (2015)
  • 著者名/発表者名: 関川貴寛
  • 学会等名: 5th International Giardia & Cryptosporidium Conference
  • 発表場所: Uppsala Konsert & Kongress（ウプサラ，スウェーデン）
  • 年月日: 2015-05-27 – 2015-05-30
• [学会発表] 熱応答性磁性ナノ粒子を用いたクリプトスポリジウム遺伝子検査法の開発 (2015)
  • 著者名/発表者名: 関川貴寛，謝小毛，大西徳幸
  • 学会等名: 第49回日本水環境学会年会
  • 発表場所: 金沢大学（石川県金沢市）
  • 年月日: 2015-03-16 – 2015-03-18
• [学会発表] A new method for sensitive detection of Cryptosporidium RNA by surfactant extraction treatment and one-step RT-PCR (2015)
  • 著者名/発表者名: 関川貴寛，戸敷浩介
  • 学会等名: 3rd International Feacal Sludge Management Conference
  • 発表場所: Meliá Hanoi（ハノイ，ベトナム）
  • 年月日: 2015-01-18 – 2015-01-21
• [学会発表] 界面活性剤抽出処理とRT-qPCRを用いたクリプトスポリジウムの迅速･高感度検出法の開発 (2014)
  • 著者名/発表者名: 関川 貴寛
  • 学会等名: 第48回日本水環境学会年会
  • 発表場所: 東北大学川内北キャンパス（宮城県仙台市）
• [学会発表] Simple and sensitive detection of the 18S rRNA gene from Cryptosporidium parvum oocysts by surfactant extraction treatment (2013)
  • 著者名/発表者名: 関川 貴寛
  • 学会等名: First EMBO Conference on Aquatic Microbial Ecology
  • 発表場所: The Conference Palace of Stresa （ストレーザ，イタリア）
• [学会発表] RT-LAMP法を用いたクリプトスポリジウムRNAの高感度検出 (2013)
  • 著者名/発表者名: 関川 貴寛
  • 学会等名: 第34回日本食品微生物学会学術総会
  • 発表場所: タワーホール船堀（東京都江戸川区）
• [備考] 環境工学研究室
  • URL: http://env-eng.u-shizuoka-ken.ac.jp/env-eng/
• [備考] 静岡県立大学大学院環境工学研究室
  • URL: http://env-eng.u-shizuoka-ken.ac.jp/env-eng/
• [備考] 静岡県立大学大学院環境工学研究室ホームページ
  • URL: http://env-eng.u-shizuoka-ken.ac.jp/env-eng/
• [産業財産権] 刺激応答性磁性ナノ粒子を用いた検出対象を検出する方法 (2015)
  • 発明者名: 関川貴寛，謝小毛，大西徳幸
  • 権利者名: 静岡県公立大学法人，JNC株式会社
  • 産業財産権種類: 特許
  • 産業財産権番号: 2015-051076
  • 出願年月日: 2015-03-13
• [産業財産権] 刺激応答性磁性ナノ粒子を用いた遺伝子検査方法 (2015)
  • 発明者名: 関川貴寛，謝小毛，大西徳幸
  • 権利者名: 静岡県公立大学法人，JNC株式会社
  • 産業財産権種類: 特許
  • 産業財産権番号: 2015-051077
  • 出願年月日: 2015-03-13