構造情報に基づいた機能変換による膜孔形成毒素の会合機構の解明

• 研究領域: 生命分子システムにおける動的秩序形成と高次機能発現
• 研究課題/領域番号: 16H00748
• 研究種目: 新学術領域研究(研究領域提案型)
• 配分区分: 補助金
• 審査区分: 理工系
• 研究機関: 東北大学 (2017); 北海道大学 (2016)
• 研究代表者: 田中 良和 東北大学, 生命科学研究科, 教授 (20374225)
• 研究期間 (年度): 2016-04-01 – 2018-03-31
• 研究課題ステータス: 完了 (2017年度)
• 配分額: 5,200千円 (直接経費: 4,000千円、間接経費: 1,200千円); 2017年度: 2,600千円 (直接経費: 2,000千円、間接経費: 600千円); 2016年度: 2,600千円 (直接経費: 2,000千円、間接経費: 600千円)
• キーワード: 膜孔形成毒素 / タンパク質工学 / 蛋白質 / 微生物 / バイオテクノロジー / タンパク質 / 構造解析 / 生体分子

研究実績の概要

病原性微生物がホスト細胞に障害を与えるために産生する膜孔形成毒素は，可溶性の単量体として分泌されるが，ターゲット細胞に接すると膜上でpreporeと呼ばれる円状の会合体を形成した後，劇的な構造変化を起こして膜孔を形成する．黄色ブドウ球菌は，3種類の非常に類似した膜孔形成毒素（Hla，LukF，Hlg2）を分泌するが，Hlaはホモ7量体の膜孔を形成するのに対し，LukF，Hlg2は交互に会合したヘテロ8量体の膜孔を形成する．毒素同士がどのようにして特定のパートナーとのみ特異的に会合して膜孔を形成するのか，また，7量体・8量体という分子の会合数がどのようにして決定されるのかについては，明らかにできていない．
本研究では，構造解析から提唱された機構を基に変異体蛋白質を合理設計し，毒素の会合特性を改変することを通して，これらの毒素の自己組織化機構を解明することを目指した．立体構造情報をもとに，Hlg2とLukFの接触界面を移植したキメラ変異体を2種類作成した．また，コンピュータシミュレーションにより単量体として機能できるように，界面の残基の変異体を設計した．4種類の変異体を作成した．これらに加え，2成分性毒素の各成分に対し，ステム領域をHlaのもので置換した変異体と，さらにその周辺の重要残基に変異を加えたキメラ変異体を合計16種類作成した．これらのキメラ変異体の溶血活性を種々の条件下で評価した結果，LukFのステム領域はHlaのステム領域で置換可能であることがわかった．また，Hlaのステムで置換したHlg2の種々の変異体のCDスペクトルから，ステム領域の入れ替えにより，単量体の構造に変化が起きていることが示された．また，一連の実験の過程で， Hlg2，LukFのリフォールディングの手法が確立された．

現在までの達成度 (段落)

平成29年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

平成29年度が最終年度であるため、記入しない。

研究成果

• [国際共同研究] スタンフォード大学(米国)
• [国際共同研究] マックスプランク研究所(ドイツ)
• [国際共同研究] マックスプランク研究所(ドイツ)
• [雑誌論文] Protein encapsulation in the hollow space of hemocyanin crystals containing a covalently conjugated ligand (2019)
  • 著者名/発表者名: Tsubasa Hashimoto, Yuxin Ye, Mihoko Ui, Tohohisa Ogawa, Takashi Matsui, and Yoshikazu Tanaka
  • 雑誌名: Biochem. Biophys. Res. Commun. 巻: 印刷中 号: 1 ページ: 31-36
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2019.04.062
  • 査読あり
• [雑誌論文] Cryo-EM reveals the asymmetric assembly of squid hemocyanin (2019)
  • 著者名/発表者名: Tanaka, Y., Kato, S., Stabrin, M., Raunser, S., Matsui, T. & Gatsogiannis, C.
  • 雑誌名: International Union of Crystallography (IUCr) 巻: 6 号: 3 ページ: 426-437
  • DOI: 10.1107/s205225251900321x
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] SDS-induced oligomerization of Lys49-phospholipase A2 from snake venom (2019)
  • 著者名/発表者名: Matsui Takashi、Kamata Shizuka、Ishii Kentaro、Maruno Takahiro、Ghanem Nouran、Uchiyama Susumu、Kato Koichi、Suzuki Atsuo、Oda-Ueda Naoko、Ogawa Tomohisa、Tanaka Yoshikazu
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 9 号: 1 ページ: 2330-2330
  • DOI: 10.1038/s41598-019-38861-8
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Encapsulation of biomacromolecules by soaking and co-crystallization into porous protein crystals of hemocyanin (2019)
  • 著者名/発表者名: Tsubasa Hashimoto, Yuxin Ye, Asuka Matsuno, Yuki Ohnishi, Akira Kitamura, Masataka Kinjo, Satoshi Abe, Takafumi Uenod, Min Yao, Tomohisa Ogawa, Takashi Matsuia, Yoshikazu Tanaka
  • 雑誌名: Biochemical and Biophysical Research Communications 巻: 509 号: 2 ページ: 577-584
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2018.12.096
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] staphylococcal bi-component toxin for β-barrel pore assembly (2018)
  • 著者名/発表者名: Kein Takeda, Yoshikazu Tanaka, Naoki Abe, Jun Kaneko
  • 雑誌名: Toxicon 巻: 155 ページ: 43-48
  • DOI: 10.1016/j.toxicon.2018.10.002
  • 査読あり
• [雑誌論文] Compact seahorse-shaped T cell-activating antibody for cancer therapy (2018)
  • 著者名/発表者名: Hiroto Fujii, Yoshikazu Tanaka, Hikaru Nakazawa, Aruto Sugiyama, Noriyoshi Manabe, Akira Shinoda, Nobutaka Shimizu, Takamitsu Hattori, Katsuhiro Hosokawa, Takuma Sujino, Tomoyuki Ito, Teppei Niide, Ryutaro Asano, Izumi Kumagai, and Mitsuo Umetsu
  • 雑誌名: Advanced Therapeutics 巻: 1700031 号: 3 ページ: 1-10
  • DOI: 10.1002/adtp.201700031
  • 査読あり
• [雑誌論文] Rim domain loops of Staphylococcal β-pore forming bi-component toxin S-components recognize target human erythrocytes in a coordinated manner. (2018)
  • 著者名/発表者名: Peng Z, Takeshita M, Shibata N, Tada H, Tanaka Y, Kaneko J.
  • 雑誌名: J. Biochem. 巻: 印刷中（電子版発行済） 号: 2 ページ: 93-102
  • DOI: 10.1093/jb/mvy030
  • NAID: 40021635138
  • 査読あり
• [雑誌論文] Heme binding to porphobilinogen deaminase from Vibrio cholerae decelerates the formation of 1-hydroxymethylbilane (2018)
  • 著者名/発表者名: Uchida*, T., Funamizu, T., Chen, M., Tanaka, Y., and Ishimori, K.
  • 雑誌名: ACS Chemical Biology 巻: 15 号: 3 ページ: 750-760
  • DOI: 10.1021/acschembio.7b00934
  • 査読あり
• [雑誌論文] Molluscan hemocyanin: structure, evolution, and physiology (2018)
  • 著者名/発表者名: Kato Sanae、Matsui Takashi、Gatsogiannis Christos、Tanaka Yoshikazu
  • 雑誌名: Biophysical Reviews 巻: 10-2 号: 2 ページ: 191-202
  • DOI: 10.1007/s12551-017-0349-4
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Structural basis for tRNA-dependent cysteine biosynthesis (2017)
  • 著者名/発表者名: Chen Meirong、Kato Koji、Kubo Yume、Tanaka Yoshikazu、Liu Yuchen、Long Feng、Whitman William B.、Lill Pascal、Gatsogiannis Christos、Raunser Stefan、Shimizu Nobutaka、Shinoda Akira、Nakamura Akiyoshi、Tanaka Isao、Yao Min
  • 雑誌名: Nature Commun. 巻: 8 号: 1 ページ: 1521-1521
  • DOI: 10.1038/s41467-017-01543-y
  • NAID: 120006370606
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] pH regulates pore formation of a protease activated Vip3Aa from Bacillus thuringiensis (2017)
  • 著者名/発表者名: Thittaya Kunthic, Hirokazu Watanabe, Ryuji Kawano, Yoshikazu Tanaka, Boonhiang Promdonkoy, Min Yao, Panadda Boonserm
  • 雑誌名: BBA - Biomembranes 巻: 1859 号: 11 ページ: 2234-2241
  • DOI: 10.1016/j.bbamem.2017.08.018
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Biochemical and structural characterization of oxygen-sensitive 2-thiouridine synthesis catalyzed by the iron-sulfur protein TtuA (2017)
  • 著者名/発表者名: Minghao Chen, Shin-ichi Asai, Shun Narai, Shusuke Nambu, Naoki Omura, Yuriko Sakaguchi, Tsutomu Suzuki, Masao Ikeda-Saito, Kimitsuna Watanabe, Min Yao, Naoki Shigi and, Yoshikazu Tanaka
  • 雑誌名: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 巻: 印刷中
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Structural properties of phycoerythrin from dulse palmaria palmata (2017)
  • 著者名/発表者名: Yoshikatsu Miyabe, Tomoe Furuta, Tomoyuki Takeda, Gaku Kanno, Takeshi Shimizu, Yoshikazu Tanaka, Zuoqi Gai, Hajime Yasui, Hideki Kishimura
  • 雑誌名: Journal of Food Biology 巻: 41 号: 1 ページ: e12301-e12301
  • DOI: 10.1111/jfbc.12301
  • NAID: 120006382291
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Structural basis for recognition of a kink-turn motif by an archaeal homologue of human RNase P protein Rpp38 (2016)
  • 著者名/発表者名: 179.K. Oshima, Y. Kakiuchi, Y. Tanaka, T. Ueda, T. Nakashima, M. Kimura, and M. Yao
  • 雑誌名: Biochem. Biophys. Res. Commun 巻: ４７４ 号: 3 ページ: 541-546
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2016.04.118
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著 / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Crystallographic study of the 2-thioribothymidine-synthetic complex TtuA-TtuB from Thermus thermophilus (2016)
  • 著者名/発表者名: Chen M, Narai S, Omura N, Shigi N, Chimnaronk S, Tanaka Y, Yao M
  • 雑誌名: Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications 巻: F72 号: 10 ページ: 777-781
  • DOI: 10.1107/s2053230x16014242
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] 超巨大蛋白質会合体ヘモシアニンのX線結晶構造解析 (2016)
  • 著者名/発表者名: 松野明日香，田中良和
  • 雑誌名: 日本結晶学会誌 巻: 58 ページ: 91-95
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [学会発表] 蛋白質結晶中の巨大な空隙へのタンパク質の包摂 (2019)
  • 著者名/発表者名: 橋本翼, 松井崇, 小川智久，田中良和
  • 学会等名: PFシンポジウム
• [学会発表] スルメイカ由来ヘモシアニンのクライオ電顕構造とX 線結晶構造の違い (2018)
  • 著者名/発表者名: 田中良和，松井崇，加藤早苗，Christos Gatsogiannis, Stefan Raunser
  • 学会等名: 日本蛋白質科学会
• [学会発表] Molecular Mechanism of Staphylococcal Pore Forming Toxin (2018)
  • 著者名/発表者名: Yoshikazu TANAKA, Jun KANEKO
  • 学会等名: The 79th Okazaki Conference Synthetic, Biological, and Hybrid Molecular Engines
  • 国際学会
• [学会発表] 巨大蛋白質会合体ヘモシアニンの構造解析 (2018)
  • 著者名/発表者名: 田中良和
  • 学会等名: 日本生物物理学会 東北支部会
• [学会発表] X線結晶構造解析とクライオ電顕、両手法を使って (2018)
  • 著者名/発表者名: 田中良和
  • 学会等名: フォトンファクトリー研究会 X線とクライオ電子顕微鏡で挑む生命の機能とかたち
  • 招待講演
• [学会発表] Encapsulation of Biomacromolecule into Porous Crystal of a Huge Protein Complex Hemocyanin (2017)
  • 著者名/発表者名: Koji Kato, Asuka Matsuno, Yuxin Ye, Yuki Ohnishi, Akira Kitamura, Masataka Kinjo, Satoshi Abe, Takashi Ueda, Yoshikazu Tanaka, Min Yao
  • 学会等名: 新学術領域研究「動的秩序と機能」第5回国際シンポジウム
  • 発表場所: 東京大学(東京都，目黒区)
  • 年月日: 2017-01-21
  • 国際学会
• [学会発表] Pore formation mechanism of staphylococcal pore forming toxin (2016)
  • 著者名/発表者名: Yoshikazu Tanaka
  • 学会等名: Max Planck Institute of Molecular Physiology Department 3 Lab Retreat Seminar
  • 発表場所: Ringberg，ドイツ
  • 年月日: 2016-10-09
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] バクテリアにおけるユビチキン様翻訳後修飾の構造基盤 (2016)
  • 著者名/発表者名: 陳明皓，奈良井峻，大村直毅，鴫直樹，田中良和，姚閔
  • 学会等名: RNAフロンティアミーティング2016
  • 発表場所: いこいの湯宿いろは(北海道，虻田郡ニセコ町)
  • 年月日: 2016-08-31
• [学会発表] バクテリアにおける二機能性ユビキチン様タンパク質の機能調節の構造基盤 (2016)
  • 著者名/発表者名: 陳明皓，奈良井峻，大村直毅，鴫直樹，田中良和，姚閔
  • 学会等名: 第16回日本蛋白質科学会年会
  • 発表場所: 福岡国際会議場(福岡県，福岡市)
  • 年月日: 2016-06-07
• [学会発表] Multidomain architecture of SepCysE confers transsulfursome flexibility to synthesize Cys-tRNACys in two-step indirect pathway (2016)
  • 著者名/発表者名: Meirong Chen, Yume Kubo, Koji Kato, Yoshikazu Tanaka, Isao Tanaka, Min Yao
  • 学会等名: 第53回日本生化学会北海道支部例会 日本生化学会北海道支部・日本生物物理学会北海道支部 合同シンポジウム
  • 発表場所: 北海道大学(北海道，札幌市)
• [産業財産権] ヘモシアニン会合体を用いた包摂体の製造方法 (2016)
  • 発明者名: 田中良和，松野明日香，北村朗，金城政孝，姚閔，上野隆史，安部聡
  • 権利者名: 国立大学法人北海道大学，国立大学法人東京工業大学
  • 産業財産権種類: 特許
  • 出願年月日: 2016-06-01