| 研究領域 | 過渡的複合体が関わる生命現象の統合的理解－生理的準安定状態を捉える新技術－ |
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| 研究課題/領域番号 |
22121509
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| 研究種目 |
新学術領域研究(研究領域提案型)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 審査区分 |
複合領域
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
七田 芳則 京都大学, 理学研究科, 教授 (60127090)
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| 研究期間 (年度) |
2010 – 2011
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| 研究課題ステータス |
完了 (2011年度)
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| 配分額 *注記 |
11,180千円 (直接経費: 8,600千円、間接経費: 2,580千円)
2011年度: 5,590千円 (直接経費: 4,300千円、間接経費: 1,290千円)
2010年度: 5,590千円 (直接経費: 4,300千円、間接経費: 1,290千円)
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| キーワード | 構造変化 / ロドプシン / 蛍光プローブ / 平衡 / 過度的複合体 / ダイナミクス / 過渡的複合体 |
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| 研究概要 |
昨年度の研究により、Alexa594でラベルしたロドプシンからメタIとメタIIの平衡状態を生成させ、この試料について1分子蛍光観測をすると蛍光強度がステップ状の増減を繰り返すことがわかった。この実験結果と可視吸収スペクトル法での結果を詳細に解析した結果、メタIとメタIIの状態がそれぞれGタンパク質を活性化する構造としない構造の2状態になっていることを発見した。また、7員環レチナールを加えて光反応を起こらなくしたロドプシンやタンパク質部分のみ(オプシン)の1分子蛍光観測をした結果、増減の頻度は低いがこれらも2状態になることがわかった。さらに、各状態のGタンパク質活性化効率を測定したところ、蛍光増減の起こる頻度と相関を示すことを見いだした。また、2状態間の蛍光強度の葦はロドプシンおよびオプシンのほうが大きい可能性が示唆された。これらの結果を現在論文としてまとめている。
また、リガンドが結合しなくてもGタンパク質活性化能を示す変異体(構成的活性変異体)について、上記と同様の実験を行うことを試みた。培養細胞で発現させた野生型ロドプシンでは、外節膜中のロドプシンに比べてラベル化効率が非常に低かった。そこで、ラベル化条件を最適化したところ、ROS中のロドプシンと同様に、蛍光強度によって活性構造をとらえることができた。構成的活性変異体も同じ条件で蛍光ラベルされることが確認できたので、今後は、1分子蛍光観測を行う予定である。一方、Gタンパク質のC末端ペプチド(11残基)とメタIIとの結合を利用して複合体での1分子FRET観測も試みた。しかし、ドナーの消光、あるいはアクセプターの発光で両者の結合を観測することは現在成功していない。これは、1分子観測では非常に低濃度の試料牽用いているためにペプチドとメタIIの結合効率が低いことも一因であると考えられるので、より高濃度での観測を行っている。
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