分子動力学／自由エネルギー計算によるＶ１ーＡＴＰａｓｅの機能発現機構の解明

• 研究領域: 水を主役としたＡＴＰエネルギー変換
• 研究課題/領域番号: 23118705
• 研究種目: 新学術領域研究(研究領域提案型)
• 配分区分: 補助金
• 審査区分: 複合領域
• 研究機関: 千葉大学
• 研究代表者: 村田 武士 千葉大学, 理学(系)研究科(研究院), 准教授 (80415322)
• 研究期間 (年度): 2011-04-01 – 2013-03-31
• 研究課題ステータス: 完了 (2012年度)
• 配分額: 4,940千円 (直接経費: 3,800千円、間接経費: 1,140千円); 2012年度: 2,470千円 (直接経費: 1,900千円、間接経費: 570千円); 2011年度: 2,470千円 (直接経費: 1,900千円、間接経費: 570千円)
• キーワード: 分子モーター / 酵素反応 / V-ATPase / 計算機シミュレーション

研究実績の概要

本研究では得られたV1-ATPaseの結晶構造と機能を繋ぐ計算機シミュレーションを用いた解析や重要残基変異体の構造機能解析を行い、V1-ATPaseのATP加水分解による機能発現機構の解明を目的とする。当初研究計画に従って、下記の研究結果を得た。
分子動力学／自由エネルギー計算によるATP結合部位への基質結合親和性の算出---V1-ATPaseの３箇所のATP結合部位は、ヌクレオチドに対してそれぞれ違う親和性を持つことが実験的に示されているが、それぞれの結合親和性がどの箇所に対応するかは実証されていない。今年度は新たに得られた結晶構造のAMP-PNPを結合している２つのAサブユニット単体について、エネルギー計算によるATP結合部位への基質結合親和性を算出した。
分子動力学シミュレーションによる触媒サブユニットの揺らぎと水和の解析---前年度の短時間シミュレーションの結果を基に、V1-ATPaseの回転軸にトルクを掛けたTargeted MDを10 nS行った。合成方向と分解方向への回転に伴ったA3B3複合体の構造変化の違いについて調べた。
機能発現に重要な残基の変異酵素の作製と機能構造解析---上記の解析で得られた結果から予想されるヌクレオチド結合に重要と考えられる残基やDG複合体とA3B3複合体の接触面に位置し、回転反応に重要と考えられる残基に関して、部位特異的変異導入を行った。得られた変異V1-ATPaseを精製し、A3B3複合体とDG複合体の結合の親和性及びATPase活性への影響を調べた。これによりDG複合体の役割の一端を理解することができた。

現在までの達成度 (段落)

24年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

24年度が最終年度であるため、記入しない。

研究成果

• [雑誌論文] Rotation mechanism of Enterococcus hirae V 1-ATPase based on asymmetric crystal structures (2013)
  • 著者名/発表者名: Satoshi Arai, Shinya Saijo, Kano Suzuki, Kenji Mizutani, Yoshimi Kakinuma, Yoshiko Ishizuka-Katsura, Noboru, Ohsawa, Takaho Terada, Mikako Shirouzu, Shigeyuki Yokoyama, So Iwata, Ichiro Yamato and Takeshi Murata
  • 雑誌名: Nature 巻: 493 号: 7434 ページ: 703-707
  • DOI: 10.1038/nature11778
  • 査読あり
• [雑誌論文] Biochemical and biophysical properties of interactions between subunits of the peripheral stalk region of human V-ATPase (2013)
  • 著者名/発表者名: Suhaila Rahman, Ichiro Yamato, Shinya Saijo, Kenji Mizutani, Yoshiko Ishizuka-Katsura, Noboru Ohsawa, Takaho Terada, Mikako Shirouzu, Shigeyuki Yokoyama, So Iwata and Takeshi Murata
  • 雑誌名: PLoS ONE 巻: 8 号: 2 ページ: e55704-e55704
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0055704
  • 査読あり
• [雑誌論文] Mutagenesis of the residues forming an ion binding pocket of the NtpK subunit of Enterococcus hirae V-ATPase (2012)
  • 著者名/発表者名: Miyuki Kawano-Kawada
  • 雑誌名: J. Bacteriol. 巻: 194 号: 17 ページ: 4546-4549
  • DOI: 10.1128/jb.00714-12
  • 査読あり
• [雑誌論文] Calculating the Na+ translocating V-ATPase catalytic site affinity for substrate binding by homology modeled NtpA monomer using molecular dynamics/free energy calculation (2012)
  • 著者名/発表者名: Zahed Muhammed
  • 雑誌名: J.Mol.Graph.Model. 巻: (印刷中) ページ: 59-66
  • DOI: 10.1016/j.jmgm.2012.03.006
  • 査読あり
• [雑誌論文] Crystal structure of the central axis DF complex of the prokaryotic V-ATPase (2011)
  • 著者名/発表者名: Saijo, S.
  • 雑誌名: Pioc Natl Acad Sci USA 巻: 108 号: 50 ページ: 19955-19960
  • DOI: 10.1073/pnas.1108810108
  • 査読あり
• [学会発表] Crystallization of membrane proteins using functional antibody fragments (2012)
  • 著者名/発表者名: Takeshi Murata
  • 学会等名: AsCA 12/CRYSTAL 28
  • 発表場所: オーストラリア（アデレード）
  • 招待講演
• [学会発表] V1-ATPaseのX線結晶構造解析 (2011)
  • 著者名/発表者名: 村田武士
  • 学会等名: 第37回生体エネルギー研究会
  • 発表場所: 京都産業大学(京都府)
  • 年月日: 2011-12-22
• [学会発表] Enterococcus hirae由来V_1-ATPaseの結晶構造解析 (2011)
  • 著者名/発表者名: 西條慎也
  • 学会等名: 第84回生化学会
  • 発表場所: 京都国際会館(京都府)
  • 年月日: 2011-09-22
• [学会発表] V1-ATPaseの結晶構造から見えてきた回転メカニズム (2011)
  • 著者名/発表者名: 村田武士
  • 学会等名: 第11回日本蛋白質科学会
  • 発表場所: 阪急エキスポパーク(大阪府)(招待講演)
  • 年月日: 2011-06-09
• [図書] 抗体を用いた膜タンパク質の結晶構造解析 (2012)
  • 著者名/発表者名: 日野智也
  • 総ページ数: 5
  • 出版者: NTS 新機能抗体開発ハンドブック
• [備考] 非対称な結晶構造から明らかになったV1-ATPaseの回転機構
  • URL: http://first.lifesciencedb.jp/archives/6593