| 研究領域 | 細胞機能を司るオルガネラ・ゾーンの解読 |
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| 研究課題/領域番号 |
17H06422
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
原田 彰宏 大阪大学, 医学系研究科, 教授 (40251441)
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| 研究分担者 |
木下 タロウ 大阪大学, 微生物病研究所, 寄附研究部門教授 (10153165)
西野 美都子 大阪大学, 産業科学研究所, 准教授 (30510440)
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| 研究期間 (年度) |
2017-06-30 – 2022-03-31
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| キーワード | ゴルジ体 / GPI修飾酵素 / 糖転移酵素 |
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| 研究実績の概要 |
１．GPI修飾酵素や糖転移酵素の局在する小胞体やゴルジ体の選別輸送ゾーンの視覚化
GPI修飾酵素遺伝子や糖転移酵素に、CRISPRを用いた遺伝子ノックイン法で様々なtagを挿入する。具体的には以下の実験を行った。
(1)GPI修飾酵素遺伝子や糖転移酵素にCRISPR法を用いたtagのノックインを行う。tagについては、9xc-myc, 3xV5などを用いたほか、ライブイメージングに使用できるよう、7xGFP11やSNAP-tag, CLIP-tag, Halo-tagを用いた。今年度固定サンプルについてproteoglycan合成酵素（NDST1, XYLT2など）、o-glycosylation酵素（GALNT）、N-glycosylation酵素（GnT1等）遺伝子へのノックインを行い、ノックインしたtagの染色に成功した。(2)tagをノックインした上皮細胞を固定後、tagに対する抗体を用いて蛍光免疫染色や免疫電顕用の染色後、超解像顕微鏡（計画班員の中野の有するSCLIMなど）や電子顕微鏡（トモグラフィー含む）を用いて選別輸送ゾーンの観察を行い、これらの酵素が異なるゾーンに局在することを可視化することに成功した。
２．GPIタンパク質、糖タンパク質とその修飾酵素の局在する選別輸送ゾーンとの関連
Rush systemを用いて作製した、GPIタンパク質や糖タンパク質のモデルタンパク質をCaco2細胞などに発現させて、それらのタンパク質が修飾される選別輸送ゾーン特異的に通過するか否かを検証し、固定サンプルでこれらが上記の異なるゾーンを通過することを確認出来た。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
(1)ノックインしたtagの染色は、その発現レベルによって可否が大きく左右される。我々はいくつかの遺伝子について発現量とその染色の有無を比較し、可視化できる発現レベルの閾値を概ね把握することが出来た。その結果、本年度、固定サンプルについてproteoglycan合成酵素（NDST1, XYLT2など）、o-glycosylation酵素（GALNT）、N-glycosylation酵素（GnT1等）遺伝子へのノックインを行い、ノックインしたtagの染色に無事成功したため。
(2)tagをノックインした上皮細胞を固定後、tagに対する抗体を用いて蛍光免疫染色や免疫電顕用の染色後、超解像顕微鏡や電子顕微鏡を用いて選別輸送ゾーンの観察を行い、これらの酵素が異なるゾーンに局在することを可視化することに成功したため。
２．GPIタンパク質、糖タンパク質とその修飾酵素の局在する選別輸送ゾーンとの関連
Rush systemを用いて作製した、GPIタンパク質や糖タンパク質のモデルタンパク質をCaco2細胞などに発現させて、それらのタンパク質が修飾される選別輸送ゾーン特異的に通過するか否かを検証し、固定サンプルでこれらが上記の異なるゾーンを通過することを確認出来たため。
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| 今後の研究の推進方策 |
１．GPI修飾酵素や糖転移酵素の局在する小胞体やゴルジ体の選別輸送ゾーンの視覚化
GPI修飾酵素遺伝子や糖転移酵素に、CRISPRを用いた遺伝子ノックイン法で様々なtagを挿入する。具体的には以下の実験を行った。
(1)さらに追加して、GPI修飾酵素遺伝子や糖転移酵素にCRISPR法を用いたtagのノックインを行う。具体的には、ライブイメージング用のtagをスクリーニングする、既に固定サンプルの染色に成功したtagについては、複数の種類のtagを用いて複数の糖転移酵素などの2重、3重染色を行い、それらの相対的な位置関係を調べる。
(2)tagをノックインした上皮細胞を固定後、tagに対する抗体を用いて蛍光免疫染色や免疫電顕用の染色後、超解像顕微鏡や電子顕微鏡を用いてこれらの酵素が異なるゾーンに局在することを可視化する。また１でライブイメージング用のtagのノックインに成功した場合、ライブイメージングを行って、これらの酵素の動きを調べる。
２．GPIタンパク質、糖タンパク質とその修飾酵素の局在する選別輸送ゾーンとの関連
Rush systemを用いて作製した、GPIタンパク質や糖タンパク質のモデルタンパク質をCaco2細胞などに発現させて、それらのタンパク質が修飾される選別輸送ゾーン特異的に通過するか否かを検証し、生細胞でこれらが上記の異なるゾーンを通過することを確認する。
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