上皮細胞の極性輸送における細胞小器官内選別輸送ゾーンの有無とその意義

2021 年度 実績報告書

• 研究領域: 細胞機能を司るオルガネラ・ゾーンの解読
• 研究課題/領域番号: 17H06422
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 原田 彰宏 大阪大学, 大学院医学系研究科, 教授 (40251441)
• 研究分担者: 木下 タロウ 大阪大学, 微生物病研究所, 特任教授(常勤) (10153165) ; 西野 美都子 大阪大学, 産業科学研究所, 准教授 (30510440)
• 研究期間 (年度): 2017-06-30 – 2022-03-31
• キーワード: 選別輸送ゾーン

研究実績の概要

１．GPI修飾酵素や糖転移酵素の局在する小胞体やゴルジ体の選別輸送ゾーンの視覚化：いくつかの糖転移酵素の遺伝子は既にハエの上皮細胞においてゴルジ体の一部に限局することが知られている。そこで哺乳動物の上皮細胞株Caco2でゴルジ体に局在する糖鎖合成酵素遺伝子（proteoglycan合成酵素、o-glycosylation酵素、N-glycosylation酵素遺伝子）に、CRISPRを用いた遺伝子ノックイン法で様々なtag（c-myc, Haloなど）を挿入した。tagをノックインした上皮細胞を固定後、tagに対する抗体を用いて 免疫染色や免疫電顕用の染色後、超解像顕微鏡（計画班員の中野の有するSCLIMなど）や電子顕微鏡（トモグラフィー含む）を用いて選別輸送ゾーンの観察を行った。さらにライブイメージングによる解析も行った。
２．GPIタンパク質、糖タンパク質とその修飾酵素の局在する選別輸送ゾーンとの関連：Rush systemを用いて作製した、GPIタンパク質や糖タンパク質のモデルタンパク質をCaco2細胞などに発現させて、それらのタンパク質が修飾される選別輸送ゾーン特異的に通過することを観察した。
３．選別輸送ゾーンの形成に関与する分子の同定：１の結果として、異なる糖鎖合成酵素はゴルジ体で異なる部位（ゾーン）を占めることが示唆された。そのため、これらの糖転移酵素がどのような分子機構でそのようなゾーンを形成するか、これらの糖転移酵素の遺伝子にビオチン化酵素（APEX, BioIDなど）をノックインし、ビオチン化される分子を同定した。今後、それらのノックダウンなどによってゾーンの分布の変化の有無を解析し、ゾーン形成への関与を解明する。

現在までの達成度 (段落)

令和3年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

令和3年度が最終年度であるため、記入しない。

研究成果

• [雑誌論文] The Hypothalamic Paraventricular Nucleus Is the Center of the Hypothalamic Pituitary Thyroid Axis for Regulating Thyroid Hormone Levels (2022)
  • 著者名/発表者名: Yuri Kondo, Atsushi Ozawa, Daisuke Kohno, Kazuma Saito, Battsetseg Buyandalai, Sayaka Yamada, Kazuhiko Horiguchi, Yasuyo Nakajima, Nobuyuki Shibusawa, Akihiro Harada, Hideaki Yokoo, Hideo Akiyama, Tsutomu Sasaki, Tadahiro Kitamura, Masanobu Yamada
  • 雑誌名: Thyroid 巻: 32 ページ: 105-114
  • DOI: 10.1089/thy.2021.0444
  • 査読あり
• [学会発表] Loss of Rab6a in the small intestine causes lipid accumulation and epithelial cell death from lactation (2022)
  • 著者名/発表者名: Akihiro Harada
  • 学会等名: 日本解剖学会学術集会
• [備考] 大阪大学大学院 細胞生物学 原田彰宏研究室
  • URL: https://www.harada-lab.online/