タンパク分解系障害による脳内環境変調と神経変性メカニズム

2012 年度 実績報告書

• 研究領域: 脳内環境：恒常性維持機構とその破綻
• 研究課題/領域番号: 23111002
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 高橋 良輔 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (90216771)
• 研究分担者: 漆谷 真 滋賀医科大学, 学内共同利用施設等, 准教授 (60332326)
• 研究期間 (年度): 2011-04-01 – 2016-03-31
• キーワード: 脳神経疾患 / 神経科学 / 遺伝子 / 内科 / トランスレーショナルリサーチ

研究実績の概要

1)26SプロテアソームのRpt3サブユニットのATPase部分をコードするエクソンをloxP配列で囲んだfloxed Rpt3マウスを作製し、これとVAChT-Creマウスを交配させることによって、運動ニューロン特異的にRpt3を欠損するマウスを樹立し、UPSの破綻によって、進行性に運動機能障害を生じ、TDP43,FUS陽性細胞質内封入体を形成し、病理学的にもALSに酷似する運動ニューロン病マウスモデルを確立した（Tashiro et al.JBC, 2013）。
2) TDP-43の構造解析による孤発性ALSの病的パスウェイの同定
①TDP-43（野生型、FALS型、細胞質型）の過剰発現で、発現変動を示す因子の解析を進め結果、２４時間後と５日後の両者で発現低下しているシナプス後肥厚（PSD蛋白質）を同定した。本タンパク質の機能解析実験を開始し、評価系としての不死化運動ニューロン細胞の分化型培養法を確立した。
②TDP-43のミスフォールディングに関連する局所アミノ酸構造の同定と、それを特異的に認識する抗体の開発
TDP-43のRNA結合ドメイン（RRM1,RRM2）の構造解析により、各々の生理的コンフォメーションから逸脱した病原構造に至る責任ドメインを明らかにした。さらにRRM2ドメイン内の酸性アミノ酸に対するモノクロナール抗体がALS関連封入体を特異的に認識することを明らかにし、国際学術誌に報告した（Shodai, et al, PLOS ONE 2012）。さらにRRM1ドメインの特定のβシート構造がストレス下のTDP-43の異常会合に寄与することを明らかにし、RRM1ドメインの異常会合がTDP-43プロテイノパチーの多くの細胞病理学的再現することから、TDP-43病原性獲得の分子基盤である可能性を指摘し国際学術誌に報告した（Shodai et al, JBC 2013）。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

運動ニューロン特異的プロテアソーム欠損マウスは孤発性ALSの臨床症状と病理所見を忠実に再現した初めてのモデルである。プロテアソームによる蛋白質分解異常が孤発性ALSの原因に関与していることを示す強い実験的証拠を提出したことで、今後孤発性ALSの病因解明が進むものと考えている。
TDP-43の病原構造への変換に関わる局所分子構造異常を明らかにし、病原性TDP-43を特異的に認識する抗体の開発に成功し、国際学術誌に報告した。さらにこの構造解析結果に基づいてin vitroのTDP-43プロテイノパチーモデルを確立し、今後ハイスループットスクリーニングやあらたなin vivoモデルへの応用性を広げた。

今後の研究の推進方策

1) 運動ニューロン特異的プロテアソーム欠損マウスの脊髄全体、および運動ニューロンのみをレーザーマイクロダイセクションで切り取ったものから、RNAを抽出し、マイクロアレイによる解析を行う。また、その結果をヒトALS剖検例のマイクロアレイの結果と比較検討し、ヒトとマウスで共通して運動ニューロン変性のバイオマーカーになりうる分子を同定する。
2) TDP-43の過剰発現によって発現低下するPSD蛋白質の機能低下による神経細胞の異常現象について細胞生物学的に、さらに動物実験によって検討する。さらに、TDP-43のモノクロナール抗体のscFvを構築し細胞内抗体による細胞内TDP-43の分子標的治療を開発する。

研究成果

• [雑誌論文] Aberrant assembly of RNA-recognition motif 1 links to pathogenic conversion of TAR DNA-binding protein-43 (TDP-43) (2013)
  • 著者名/発表者名: Shodai A, Morimura T, Ido A, Uchida T, Ayaki T, Takahashi R, Kitazawa S, Suzuki S, Shirouzu M, Kigawa T, Muto Y, Yokoyama S, Takahashi R, Kitahara R, Ito H, Fujiwara N, Urushitani M
  • 雑誌名: J Biol Chem 巻: 288(21) ページ: 14886-14905
  • DOI: 10.1074/jbc.M113.451849
  • 査読あり
• [雑誌論文] Visualization of Lenticulostriate Arteries by Flow-Sensitive Black-Blood MR Angiography on a 1.5T MRI System: A Comparative Study between Subjects with and without Stroke. AJNR Am J Neuroradiol. (2013)
  • 著者名/発表者名: Okuchi S
  • 雑誌名: AJNR Am J Neuroradiol 巻: 34(4) ページ: 780-4.
  • DOI: 10.3174/ajnr.A3310.
  • 査読あり
• [雑誌論文] In vivo imaging of brain ischemia using an oxygen-dependent degradative fusion protein probe. (2013)
  • 著者名/発表者名: Fujita Y
  • 雑誌名: PLoS One 巻: 7(10) ページ: e48051
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0048051.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Conserved Acidic Amino Acid Residues in a Second RNA Recognition Motif Regulate Assembly and Function of TDP-43 (2012)
  • 著者名/発表者名: Shodai A
  • 雑誌名: PLoS ONE 巻: 7 ページ: e52776
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0052776
  • 査読あり
• [雑誌論文] Motor Neuron-specific Disruption of Proteasomes, but not Autophagy, Replicates Amyotrophic Lateral Sclerosis. (2012)
  • 著者名/発表者名: Tashiro Y
  • 雑誌名: J Biol Chem 巻: 287 ページ: 42984-42994
  • DOI: 10.1074/jbc.M112.417600
  • 査読あり
• [雑誌論文] 変異SOD1タンパク質によるALSの病態機序. (2012)
  • 著者名/発表者名: 漆谷 真
  • 雑誌名: 脳21 巻: 15 ページ: 9-15
• [雑誌論文] Gain of function by phosphorylation in Presenilin 1-mediatd regulation of insulin signaling. (2012)
  • 著者名/発表者名: Maesako M
  • 雑誌名: J Neurochem 巻: 121(6) ページ: 964-73
  • DOI: 10.1111/j.1471-4159.2012.07741.x.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Parkin interacts with Klokin1 for mitochondrial import and maintenance of membrane potential. (2012)
  • 著者名/発表者名: Kuroda Y
  • 雑誌名: Hum Mol Genet 巻: 21(5) ページ: 991-1003
  • 査読あり
• [雑誌論文] A rat model for LGI1-related epilepsies. (2012)
  • 著者名/発表者名: Baulac S
  • 雑誌名: Hum Mol Genet. 巻: 21(16) ページ: 3546-57
  • DOI: 10.1093/hmg/dds184.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Exercise Is More Effective than Diet Control in Preventing High Fat Diet-induced β-Amyloid Deposition and Memory Deficit in Amyloid Precursor Protein Transgenic Mice. (2012)
  • 著者名/発表者名: Maesako M
  • 雑誌名: J Biol Chem. 巻: 287(27) ページ: 23024-33
  • DOI: 10.1074/jbc.M112.367011.
  • 査読あり
• [雑誌論文] α-Synuclein BAC transgenic mice as a model for Parkinson's disease manifested decreased anxiety-like behavior and hyperlocomotion. (2012)
  • 著者名/発表者名: Yamakado H
  • 雑誌名: Neurosci Res 巻: 73(2) ページ: 173-7
  • DOI: 10.1016/j.neures.2012.03.010.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Parkin pathway activation mitigates glioma cell proliferation and predicts patient survival. (2012)
  • 著者名/発表者名: Yeo CW
  • 雑誌名: Cancer Res 巻: 72(10) ページ: 2543-53.
  • DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-11-3060.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Donor-dependent variations in hepatic differentiation from human-induced pluripotent stem cells. (2012)
  • 著者名/発表者名: Kajiwara M
  • 雑誌名: Proc Natl Acad Sci U S A. 巻: 109(31) ページ: 12538-43.
  • DOI: 10.1073/pnas.1209979109.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Drug Screening for ALS Using Patient-Specific Induced Pluripotent Stem Cells. (2012)
  • 著者名/発表者名: Egawa N
  • 雑誌名: Sci Transl Med. 巻: 4(145) ページ: 145-104.
  • DOI: 10.1126/scitranslmed.3004052.
  • 査読あり
• [雑誌論文] "Hot cross bun" sign in multiple system atrophy with predominant cerebellar ataxia: A comparison between proton density-weighted imaging and T2-weighted imaging. (2012)
  • 著者名/発表者名: Kasahara S
  • 雑誌名: Eur J Radiol 巻: 81(10) ページ: 2848-52.
  • DOI: 10.1016/j.ejrad.2011.12.012.
  • 査読あり
• [学会発表] Regulation of the PINK1 signaling by a mitochondrial protein PGAM5. (2012)
  • 著者名/発表者名: Sawada T
  • 学会等名: Neuroscience 2012
  • 発表場所: New Orleans, U.S.A.
  • 年月日: 2012-10-15
• [学会発表] BACテクノロジーを用いたパーキンソン病の治療薬候補の探索 (2012)
  • 著者名/発表者名: 浅野剛史
  • 学会等名: 第6回パーキンソン病・運動障害疾患コングレス
  • 発表場所: 京都ホテルオークラ
  • 年月日: 2012-10-13
• [学会発表] トランスグルタミナーゼ２によるSOD1オリゴマー形成を標的にしたALSモデルマウスの治療解析 (2012)
  • 著者名/発表者名: 大野美樹
  • 学会等名: 第35回日本神経科学大会
  • 発表場所: 名古屋国際会議場
  • 年月日: 2012-09-18 – 2012-09-21
• [学会発表] 培養細胞モデルを用いたALSにおけるTDP-43の分子的機構の解析 (2012)
  • 著者名/発表者名: 内田 司
  • 学会等名: 第35回日本神経科学大会
  • 発表場所: 名古屋国際会議場
  • 年月日: 2012-09-18 – 2012-09-21
• [学会発表] α-synuclein BAC transgenic mice as a model for Parkinson’s disease manifested decreased anxiety-like behavior. (2012)
  • 著者名/発表者名: Yamakado H,
  • 学会等名: The MDS 17th International Congress of Parkinson's Disease and Movement Disorders
  • 発表場所: Dablin, Ireland
  • 年月日: 2012-06-21
• [学会発表] ALS病態におけるtransglutaminase2を介したSOD1オリゴマー形成の関与 (2012)
  • 著者名/発表者名: 大野美樹
  • 学会等名: 第53回日本神経学会学術大会
  • 発表場所: 東京国際フォーラム
  • 年月日: 2012-05-22 – 2012-05-25
• [学会発表] テトラサイクリン誘導性にTDP-43を発現するヒト神経由来細胞の樹立とその応用 (2012)
  • 著者名/発表者名: 内田 司
  • 学会等名: 第53回日本神経学会学術大会
  • 発表場所: 東京国際フォーラム
  • 年月日: 2012-05-22 – 2012-05-25
• [学会発表] CONGNITIVE AND PHYCHIATRIC FEATURES IN ANIMAL PD MODELS. (2012)
  • 著者名/発表者名: Takahashi R
  • 学会等名: 8th International Congress On Mental Dysfunction Other Non-Motor Features In Parkinson’s Diease and Related Disorders
  • 発表場所: Berlin, Germany
  • 年月日: 2012-05-04
  • 招待講演
• [図書] すべてがわかる筋萎縮性側索硬化症・運動ニューロン疾患 (2013)
  • 著者名/発表者名: 漆谷 真
  • 総ページ数: 384
  • 出版者: 中山書店
• [図書] Amyotrophic Lateral Sclerosis: Symptoms, Treatment and Prognosis. (2013)
  • 著者名/発表者名: Urushitani M and Morimura T
  • 総ページ数: 23
  • 出版者: Nova Science Publishers, Inc.
• [備考] 滋賀医科大学 神経難病研究機構 分子神経科学研究センター 神経難病治療学分野
  • URL: http://www.shiga-med.ac.jp/~uru/index.html
• [備考] 脳内環境
  • URL: http://www.neurol.med.kyoto-u.ac.jp/brainenvironment/#
• [産業財産権] TDP-43の凝集体が蓄積する疾患を治療 (2013)
  • 発明者名: 漆谷真、藤原範子、北原 亮、伊東秀文
  • 権利者名: 滋賀医科大学、兵庫医科大学、立命館大学
  • 産業財産権種類: 特許
  • 産業財産権番号: 2013-046451
  • 出願年月日: 2013-03-08