細胞競合に関与するストレス応答分子の探索

2014 年度 実績報告書

• 研究領域: 細胞競合：細胞社会を支える適者生存システム
• 研究課題/領域番号: 26114009
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 一條 秀憲 東京大学, 薬学研究科(研究院), 教授 (00242206)
• 研究期間 (年度): 2014-07-10 – 2019-03-31
• キーワード: 細胞競合 / ゲノムワイドsiRNAスクリーニング / Scribble / ASK1

研究実績の概要

本研究の目的は哺乳類細胞において細胞競合を司る分子メカニズムをストレス応答の観点から明らかにすることである。平成26年度は当初の計画どおりに、(1)ゲノムワイドsiRNAスクリーニングによる網羅的アプローチ、および(2)既知のストレス応答分子の関与の検討を中心としたCandidateアプローチに関して検討を行った。
(1)については、哺乳類の培養細胞系の細胞競合を全自動イメージアナライザーで解析する系の構築を試みた。スクリーニングは大量のサンプルを扱うことになるため、細胞競合現象を迅速かつ客観的に評価する系が必須となる。我々は画像から細胞を規定し、その個々の細胞の蛍光強度を測ることで、蛍光を持つ細胞と持たない細胞、それぞれの細胞数を計測するようなシステムを構築した。実際に領域代表者の藤田が開発したMDCK細胞のScribble欠損による細胞競合モデルをこのシステムで解析した。GFPを発現するテトラサイクリン誘導性Scribble欠損細胞とGFPを発現しない正常細胞を前述した方法で区別し、それぞれの数を数えたところ、テトラサイクリンによる変異誘導時にScribble欠損細胞の数が減るという細胞競合で見られる現象が観察された。我々が所有するsiRNAライブラリーはヒトまたはマウスのゲノムを対象にしたものなので、現在ヒトまたはマウスの培養細胞の細胞競合のモデルを作製中である。
(2)については、MDCK細胞でScribble欠損による競合モデルに関して、阻害剤およびsiRNAを用いてASKファミリー分子およびその下流で働くストレス応答性MAPKの寄与を検証した。ASKファミリーおよびp38の阻害剤の処置および、ASK1の発現抑制によって程度は低いながらもScribble欠損細胞の数の減少が見られた。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

本年度は全自動イメージアナライザーで細胞競合を客観的に評価する系の構築をすることができた。この評価系はゲノムワイドsiRNAスクリーニングを迅速かつ客観的に行う上で欠かせない系であるため、この系の構築ができたことは計画のsiRNAスクリーニング系の構築が順調に進んでいることを示している。また、この系をCandidateアプローチにも使用し、ASKファミリーおよびp38のScribble欠損による細胞競合に関与していることを示唆できた。以上のことから計画がおおむね順調に進展していると言える。

今後の研究の推進方策

ゲノムワイドsiRNAスクリーニングに関しては前述した通り、我々が保有するゲノムワイドsiRNAライブラリーに適用できるヒトまたはマウスの培養細胞の細胞競合モデルを作製する。具体的には、MDCK細胞において自動イメージアナライザーで検出することに成功した、恒常的にGFPを発現し、テトラサイクリン誘導性にshRNAを発現させることでScribbleをノックダウンできる細胞の作製をすでに始めている。作製した細胞で、細胞競合が観察され、条件検討によって系の安定性を高め、スクリーニングを行う予定である。ゲノムワイドのスクリーニングはハイスループット性を保ったまま行うために、正常細胞とテトラサイクリン誘導性Scribble欠損細胞の両者をsiRNAが配置されたwellで混合培養して行う予定である。
Candidateアプローチに関しては近年、細胞競合に関わることが報告されたASKファミリーの上流で活性制御を行うSARMがASKファミリーの活性制御を介して細胞競合に関与しているかどうか検討する。また、Scribbleの欠損によって起こる細胞競合がどのような細胞死を介して起こっているかに関しても検討する。現在までの解析でアポトーシス阻害剤の処置によってScribble欠損細胞の細胞死が抑制されないことから、ASK1-p38経路の関与が報告されているネクローシスの可能性などを検証する。

研究成果

• [雑誌論文] Apoptosis Signal-regulating Kinase 1(ASK1)-p38 pathway-dependent cytoplasmic translocation of the orphan nuclear receptor NR4A2 is required for oxidative stress-induced necrosis. (2015)
  • 著者名/発表者名: Watanabe, T., Sekine, S., Naguro, I., Sekine, Y. and Ichijo, H.
  • 雑誌名: J. Biol. Chem. 巻: 290 ページ: 10791-10803
  • DOI: 10.1074/jbc.M114.623280
  • 査読あり / 国際共著 / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] In vivo gene manipulation reveals the impact of stress-responsive MAPK pathways on tumor progression. (2015)
  • 著者名/発表者名: Kamiyama, M., Naguro, I. and Ichijo, H.
  • 雑誌名: Cancer Sci. 巻: 106 ページ: 785-796
  • DOI: 10.1111/cas.12676
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著 / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] The ASK family kinases differentially mediate induction of type I interferon and apoptosis during the antiviral response. (2015)
  • 著者名/発表者名: Okazaki, T., Higuchi, M., Takeda, K., Iwatsuki-Horimoto, K., Kiso, M., Miyagishi, M., Yanai, H., Kato, A., Yoneyama, M., Fujita, T., Taniguchi, T., Kawaoka, Y., Ichijo, H. and Gotoh, Y.
  • 雑誌名: Sci. Signal. 巻: 8 ページ: ra78
  • DOI: 10.1126/scisignal.aab1883
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Roquin-2 promotes ubiquitin-mediated degradation of ASK1 to regulate stress responses. (2014)
  • 著者名/発表者名: Maruyama, T., Araki, T., Kawarazaki, Y., Naguro, I., Heynen, S., Aza-Blanc, P., Ronai, Z., Matsuzawa, A. and Ichijo, H.
  • 雑誌名: Sci. Signal. 巻: 7, ページ: ra8
  • DOI: 10.1126/scisignal.2004822
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著 / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Apoptosis Signal-Regulating Kinase 1 (ASK1) as a therapeutic target. (2014)
  • 著者名/発表者名: Kawarazaki, Y., Ichijo, H. and Naguro, I.
  • 雑誌名: Expert Opin. Ther. Tar. 巻: 18 ページ: 651-664
  • DOI: 10.1517/14728222.2014.896903
  • 査読あり / 国際共著 / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] ASK1 promotes the contact hypersensitivity response through IL-17 production. (2014)
  • 著者名/発表者名: Mizukami, J. Sato, T., Camps, M., Ji, H., Rueckle, T., Swinnen, D., Tsuboi, R., Takeda, K. and Ichijo, H.
  • 雑誌名: Sci. Rep. 巻: 4 ページ: 4714
  • DOI: 10.1038/srep04714
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著 / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] The DEAH-Box RNA Helicase DHX15 activates NF-κB and MAPK signaling downstream of MAVS during antiviral responses. (2014)
  • 著者名/発表者名: Mosallanejad, K., Sekine, Y., Ishikura-Kinoshita, S., Kumagai, K., Nagano, T., Matsuzawa, A., Takeda, K., Naguro, I. and Ichijo, H.
  • 雑誌名: Sci. Signal. 巻: 7 ページ: ra40
  • DOI: 10.1126/scisignal.2004841
  • 査読あり / 国際共著 / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Lysosome rupture-activated TAK1-JNK pathway regulates NLRP3 inflammasome activation. (2014)
  • 著者名/発表者名: Okada, M., Matsuzawa, A., Yoshimura, A. and Ichijo, H.
  • 雑誌名: J. Biol. Chem. 巻: 289 ページ: 32926-32936
  • DOI: 10.1074/jbc.M114.579961
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著 / 謝辞記載あり
• [学会発表] 酸化ストレス、小胞体ストレス、浸透圧ストレス、熱産生 (2016)
  • 著者名/発表者名: 一條秀憲
  • 学会等名: 第5回徳島文理大学薬学部学術講演会
  • 発表場所: 徳島文理大学(徳島県徳島市）
  • 年月日: 2016-01-23
  • 招待講演
• [学会発表] ストレスシグナルと疾患～酸化ストレス、小胞体ストレス、浸透圧ストレス、熱産生～ (2016)
  • 著者名/発表者名: 一條秀憲
  • 学会等名: 第4回AAA（Academy of Aging and Cardiovascular-Diabetes Research)
  • 発表場所: ロイヤルパークホテル（東京都中央区）
  • 年月日: 2016-01-09 – 2016-01-10
  • 国際学会
• [学会発表] C.elegansを用いたgenome-wide RNAi screenによるASK1シグナルの新規活性化因子の同定 (2015)
  • 著者名/発表者名: 河原崎陽介、名黒功、一條秀憲
  • 学会等名: 第37回日本分子生物学会年会
  • 発表場所: パシフィコ横浜（神奈川県横浜市）
  • 年月日: 2015-11-25 – 2015-11-27
• [学会発表] Regulation of stress signaling in cell death and disease (2015)
  • 著者名/発表者名: 一條秀憲
  • 学会等名: Fifty-sixth International Symposium on "Biological Regulation and Enzyme Activity in Normal and Neoplastic Tissues"
  • 発表場所: Bologna, Italy
  • 年月日: 2015-10-05 – 2015-10-06
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] ER stress-dependent motoneuron toxicity and PPI-targeted drug screening in ALS. (2015)
  • 著者名/発表者名: 一條秀憲
  • 学会等名: 6th Cisbio htrf symposium
  • 発表場所: Brewster, MA, USA
  • 年月日: 2015-09-14 – 2015-09-17
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] 細胞がストレスを感じる仕組みと疾患 (2015)
  • 著者名/発表者名: 一條秀憲
  • 学会等名: 第22回日本免疫毒性学会
  • 発表場所: 京都大学百周年時計台記念館国際交流ホール（京都府京都市）
  • 年月日: 2015-09-10 – 2015-09-11
• [学会発表] Establishment of image-based high-throughput evaluation system for cell competition (2015)
  • 著者名/発表者名: Kawarazaki, Y., Naguro, I. and Ichijo, H.
  • 学会等名: 1st Internatinoal Symposium on Cell Competition -Cell Competition in Development and Cancer-
  • 発表場所: 京都大学 芝蘭会館（京都府京都市）
  • 年月日: 2015-09-10
  • 国際学会
• [学会発表] 小胞体ストレスと神経細胞死 (2015)
  • 著者名/発表者名: 一條秀憲
  • 学会等名: 第67回日本細胞生物学会大会
  • 発表場所: タワーホール船堀（東京都江戸川区）
  • 年月日: 2015-06-30 – 2015-07-02
  • 招待講演
• [学会発表] ストレスシグナルのリン酸化シグナル伝達系の解明 (2015)
  • 著者名/発表者名: 一條秀憲
  • 学会等名: 第15回日本蛋白質科学会年会
  • 発表場所: あわぎんホール（徳島県徳島市）
  • 年月日: 2015-06-24 – 2015-06-26
  • 招待講演
• [学会発表] Ubiquitin-dependent deguradation of ASK1 signaling pathway (2015)
  • 著者名/発表者名: Hidenori Ichijo
  • 学会等名: International Symposium on Ubiquitin and Diseases
  • 発表場所: Hunan, China
  • 年月日: 2015-06-14 – 2015-06-19
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] ASK1はADPシグナルへの作用を介して血小板の機能を制御する (2015)
  • 著者名/発表者名: 一條秀憲
  • 学会等名: 日本薬学会九州支部特別講演会
  • 発表場所: 長崎大学薬学部（長崎県長崎市）
  • 年月日: 2015-05-22
  • 招待講演
• [学会発表] 細胞競合で機能するストレス応答経路の探索 (2015)
  • 著者名/発表者名: 河原崎陽介、名黒功、一條秀憲
  • 学会等名: 第4回細胞競合コロキウム
  • 発表場所: 北海道大学（北海道札幌市）
  • 年月日: 2015-03-12 – 2015-03-14
• [学会発表] C.elegansを用いたgenome-wide RNAi screenによってASK1ファミリー抑制因子としてMahjongが同定された (2015)
  • 著者名/発表者名: 河原崎陽介、名黒功、一條秀憲
  • 学会等名: 第2回新学術「細胞競合」領域研究会議
  • 発表場所: 門司港ホテル（福岡県北九州市）
  • 年月日: 2015-01-13 – 2015-01-14
• [学会発表] 細胞競合に関与するストレス応答分子の探索 (2015)
  • 著者名/発表者名: 一條秀憲
  • 学会等名: 第2回新学術「細胞競合」領域研究会議
  • 発表場所: 門司港ホテル（福岡県北九州市）
  • 年月日: 2015-01-13 – 2015-01-14