筋小胞体カルシウムポンプの触媒部位の構造と作動機構に関する研究

1990 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 01580181
• 研究機関: 旭川医科大学
• 研究代表者: 金沢 徹 旭川医科大学, 医学部, 教授 (80028141)
• 研究分担者: 大保 貴嗣 旭川医科大学, 医学部, 助手 (90207267) ; 鈴木 裕 旭川医科大学, 医学部, 講師 (50183421)
• キーワード: 筋小胞体 / カルシウムポンプ / 触媒部位 / 構造解析 / 作動機構 / メカニズム / カルシウム / ATPア-ゼ

研究概要

1.昨年度は、筋小胞体Ca^<2+>ーATPaseに、触媒部位のほか、触媒部位1モル当たり1モルの低親和性ATP結合部位が存在することを示した。今回は、この両部位の相互関係を明らかにする目的で、Ca^<2+>ーATPaseに対するFITC結合を調べた。FITCは、Ca^<2+>ーATPaseに対して触媒部位1モル当たり2モル特異的に結合した。このFITC結合部位をシ-ケンシングによって同定した。その結果、FITCは触媒部位と低親和性ATP結合部位に特異的に結合すると推定されること、この結合部位は全てCa^<2+>ーATPaseのLysー515であること、従って触媒部位と低親和性ATP結合部位は一次構造的に同じものであることが示された。この結果から、筋小胞体のカルシウムポンプの機能単位はCa^<2+>ーATPaseの二量体であること、およびこの二量体のうち一方のATPase分子のATP結合部位は触媒活性をもち、他方のATPase分子のATP結合部位は触媒活性をもたない低親和性ATP結合部位であることが強く示唆された。
2.先に、我々は筋小胞体Ca^<2+>ーATPaseがイオノフォアA23187により強く阻害されることを示した。今回は、カルシウムポンプの作動機構に関する情報を得る目的で、Ca^<2+>によるATPaseの活性化に伴う構造変化とそれに対するA23187の作用を調べた。FITCでラベルした筋小胞体Ca^<2+>ーATPaseを用いて結合FITCの蛍光を測定することにより、酵素活性化に伴うCa^<2+>ーATPaseの構造変化は二相性で起こると、A23187はこの二相性の構造変化のうち遅い第二相のみを選択的に抑制することが示された。この結果から、カルシウムポンプのCa^<2+>結合部位は二つの異なったドメイインからなることが強く示唆された。

研究成果

• [文献書誌] 鈴木 裕: "筋小胞体Ca^<2+>ーATPaseに存在する二種類のATP結合部位へのFITC結合" 生化学. 62. 745-745 (1990)
• [文献書誌] 大宮 博士: "筋小胞体Ca^<2+>ーATPaseのCa^<2+>による活性化に伴う構造変化のA23187による阻害" 生化学. 62. 912-912 (1990)
• [文献書誌] Tetsuya Kawashima: "Selective Inhibition by Lasalocid of Hydrolysis of the ADPーinsensitive Phosphoenzyme in the Catalytic Cycle of Sarcoplasmic Reticulum Ca^<2+>ーATPase" The Journal of Biological Chemistry. 265. 10993-10999 (1990)
• [文献書誌] Koji Kubo: "Characterization of the Substrateーinduced Conformational Change of NーiodoacetylーN'ー(5ーsulfoー1ーnaphthyl)ethylenediamineーlabeled Sarcoplasmic Reticulum Ca^<2+>ーATPase by Using Different Kinds of Substrate" Biochimica et Biophysica Acta. 1040. 251-259 (1990)
• [文献書誌] Hiroshi Suzuki: "Existence of a LowーAffinity ATPーBinding Site in the Unphosphorylated Ca^<2+>ーATPase of Sarcoplasmic Reticulum Vesicles:Evidence from Binding of 2',3'ー0ー(2,4,6ー Trinitrocyclohexadienylidene)ー[ ^3H]AMP and ー[ ^3H]ATP" Biochemistry. 29. 7040-7045 (1990)
• [文献書誌] Hiroshi Ohmiya: "Inhibition by A23187 of Conformational Changes Involved in the Ca^<2+>ーInduced Activation of Sarcoplasmic Reticulum Ca^<2+>ーATPase" Journal of Biochemistry. (1991)