膜タンパク質スーパーコンプレックスの構築原理と結晶化条件の解明

1992 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 03304056
• 研究機関: 姫路工業大学
• 研究代表者: 吉川 信也 姫路工業大学, 理学部, 教授 (40068119)
• 研究分担者: 豊島 近 東京工業大学, 生命理工学部, 助教授 (70172210) ; 月原 冨武 徳島大学, 工学部, 教授 (00032277) ; 白木原 康雄 兵庫教育大, 自然系, 助教授 (20150287) ; 神山 勉 理化学研究所, 生物物理, 研究員 ; 安宅 光雄 生命工学工業技術研究所, 生体分子工学部, 主任研究員
• キーワード: 膜タンパク質 / 結晶化 / 結晶構造解析 / チトクロム酸化酵素 / チトクロムbc_1複合体

研究概要

チトクロム酸化酵素の正方晶系結晶の結晶化に最も重要な要因は精製の初期に使われる試薬であるコール酸に含まれる微量の不純物であることが明らかになった。コール酸を非イオン性界面活性剤に完全におき変えた後でもこの不純物の影響を除くことはできない。現在、この末同定の不純物を除去する方法を検討している。この正方晶系結晶は6Å分解能で相関係数0.5以上を示した。また重原子誘導体化に成功し、現在位置の決定を試みている。また種々の2次元結晶を作製し異なった結晶系のものを比較し、これまで信じらてきたモデルは誤っており、ダイマーの形成時に大きな構造変化が起こることが示唆された。X線回折法と電子顕微鏡によりバクテリオロドプシンの結晶構造を解折し、数百分子が集合して経50mmの球殻構造を形成し、この構造が最密充填して結晶を構成することを明らかにした。光合成細菌の集光性アンテナ色素タンパク質B800-850と好熱性細菌の反応中心複合体の結晶化に成功した。後者は3Å分解能の反射を示した。複合体IIIの精製の最終段階で微結晶化が可能になり、純度、均一性を格段に高めることに成功した。その結果六方晶系の大きい6.5ÅまでのX線回析をしめす結晶が得られた。電気ウナギNaチャンネルの簡便な高純度精製法を確立し、2次元結晶の作製を試みた。ベン毛基部体と周辺タンパク質の相互作用を調べ後者はすべて直接あるいは間接的に基部体と接触して回転子を形成していることを明らかにした。膜タンパク質の立体構造の形成因子として極性相互作用が本質的な役割を果たしていることをプローブヘリックス法のエネルギー計算を行って明かにした。これをバクテリオロドブシンに適用して構造予測を行った。チトクロム酸化酵素の結晶成長をコマ撮りビデオ装置を用いて映像的に記録したところ過飽和条件を与えるとリゾチームの場合と大きく異なりきわめて短時間で結晶成長を始めることが明かとなった。

研究成果

• [文献書誌] M.Tsubaki,: "Effects of crystallization on the heme-carbon monoxide moiety of bovine heatr cytochrome c oxidase carbonyl." Biophys. J.(1993)
• [文献書誌] K.Shinzawa-Itoh,: "Single crystals of bovine heart cytochrome c oxidase at fully oxidized resting, fully reduced and CO bound fully reduced states are isomorphous with each other." J. Mol. Biol.122. 298-302 (1992)
• [文献書誌] M.Ataka: "Phase diagrams of a membrane protein, bovine heart cytochrome c ocidase, in the salting-in region." J. Cryst. Growth.122. 60-65 (1992)
• [文献書誌] S.Yoshikawa: "Strategies for crystallization of membrane protein complexes." J. Cryst. Growth.122. 298-302 (1992)
• [文献書誌] S.Tuji: "A high resolution solid-stast ^<13>C-NMR study on crystalline bovine heart cytochrome-c oxidase and lysozyme:dynamic behavior of protein and detergent in the complex." Eur. J. Biochem.208. 713-720 (1992)
• [文献書誌] K. Fukuda and T. Kouyama: "Photoreaction of bacteriorhodopsin at high pH: Origins of the slow decay component of M." Biochemistry. 31. 11740-11747 (1992)
• [文献書誌] 安宅 光雄: "タンパク質の結晶成長" 酵素工学ニュース. 27. 14-16 (1992)
• [文献書誌] 安宅 光雄: "タンパク質の結晶成長機構" 日本結晶学会誌. 34. 238-243 (1992)
• [文献書誌] A.V.Elgersma,安宅 光雄,曽良 達生: "kinetic studies on the growth of three crytal forms of lysozyme based on the measurement of protein and Cl^- concentration chages" Journal of Crystal Growth. 122. 31-40 (1992)
• [文献書誌] 安宅 光雄,新沢(伊藤) 恭子,吉川 信也: "Phase diagrams of a crystalline membrane protein,bovine heart cytochrom c oxidase,in the salting-in reqion" Joural of Crystal Growth. 122. 60-65 (1992)
• [文献書誌] P.G.Vekolov,安宅 光雄,曽生 達生: "Laser Michelson interferometry in vestigation of protein crystal growth" Journal of Crystal Growth. (1993)
• [文献書誌] 安宅 光雄: "Protein Crystal growth: An approach based on Phase diagram determination" Phase Transition(Special Issue on Oscillation,Rhythm and Phase Transition in Biological Systems). (1993)
• [文献書誌] H.Nakayama: "Photolabeled sites with a tetrodotoxin derivative in the domain III and Iv of the electroplax sodium channel." Biochem Biophys. Res. Commun.184. 900-907 (1992)
• [文献書誌] Y.Hatanaka: "Photoaffinity laboling of the electroplax sodium channel with a photoreactive μ-conotoxin carring a radioactive and chromogenic derivative." Chem. Pharm. Bull.40. 2597-2539 (1992)
• [文献書誌] A.Kuniyasu: "Structural characterization of the cardiac calcium channel from porcine hearts." J. Biochem.112. 235-242 (1992)
• [文献書誌] H.Nakayama: "Characterization of sacchride moiety in the electroplax sodium channel" Chem. Pharm. Bull.40. 3287-3291 (1992)
• [文献書誌] H.Nakayama: "A site-directed antibody which inhibits phosphorylation of the rat brain sodium channel by cAMP-dependent protein kinase" Biochim. Biophys. Acta. 1175. 67-72 (1992)
• [文献書誌] F.Q.Chen: "3-Benzoyl-5-(4-hydroxypheny1)-2-[4-(1-azi-2,2,2-trifluoroethyl)phenylacetamido]pyrazine. A photosensitive analogue of coelenteramide. Synthesis and photolysis." Chemistry Left.(1993)
• [文献書誌] Chikashi TOYOSHIMA: "Contrast transfer for the frozen hydrated specimen. II:Amplitude contrast an very low froquencies" Ultrmicroscopy in the press. (1992)
• [文献書誌] Ayano SATO: "Two-dimensional crystallization of catalase on a monolayer film of poly(1-benzyl-L-histidine)spread at the air/water interface;" Biochim. Biophys. Acta in the press. (1993)
• [文献書誌] Chikashi TOYOSHIMA: "Cryo-electron microscopy of the calcium ion pump in the sarcoplasmic reticulum membrane" Natrure,un the press. (1993)
• [文献書誌] 豊島 近: "膜蛋白質の電子線三次元構造解析" 蛋白質・核酸・酵素. (1993)
• [文献書誌] 三木 邦夫: "膜タンパク質の構造モティーフ" 化学. 47. 499-497 (1992)
• [文献書誌] 三木 邦夫: "タンパク質結晶構造解析総括プログラム システム,“PROTEIN"の現況" 日本結晶学会誌. 34. 365-366 (1992)
• [文献書誌] S.Mitaku: "A Computer System for Predicting Membrane Protein Structure." Journal of Protein Chemisrty.11. 390-391 (1992)
• [文献書誌] M.Suwa: "Theoretical Analysis of Amino Acid Sequence of Human Dystrophin." Biopys,Biochem.Research Communications.(1992)
• [文献書誌] M.Suwa.: "Characterization of Transmembrane Helices by a Probe Helix Method of Molecular Energy Calculation" Japan.J.Appl.Phys.31. 951-956 (1992)
• [文献書誌] N.Saito: "Mechanism of Protein Folding and Its Application to Structure of Prediction of Proteins" Repotrs on Polymer Physics in Japan.35. 1-22 (1992)
• [文献書誌] S.Mutaku: "A Computer System for Predicting Membrane Protein Structure." Journal of Protein Chemisrty.11. 390-391 (1992)
• [文献書誌] K.Fukuda: "Formation and decay kinetics of bacteriorhodopsin's N intermediate:Softening the Protein conformation with alcohols affects intr-prote in proton transfer and retinal isomeirization" Photochem.Photobiol.56. 1057-1062 (1992)
• [文献書誌] 三木 邦夫: "分子設計の展望-生体高分子における分子設計" 分子設計. 1. 7-13 (1993)
• [文献書誌] 三木 邦夫: "光合成システムと反応中心のX線構造解析" 太陽エネルギー. 19. 12-19 (1993)
• [文献書誌] V.Muller: "Characterization of the flie genes of Escherichia coli and Salmonella eyphimurium and Identification of the FliE Protein as a Component of the Flagellar Hook-Basal Body Couplox." J.Bacter:01. 174. 2298-2304 (1992)
• [文献書誌] T.Kubori: "Morphological Pathmay of Flagellar Assembly in Salmonella typhymurium." J.Mol.Biol. 226. 433-446 (1992)
• [文献書誌] F.Vonderviszt: "Terminal disorder:a ammon structural feature of hook protein and flagellin." J.Mol.Biol.226. 575-579 (1992)
• [文献書誌] T.Ueno: "The Mring,Sring and Proximal rod of the flagellar bosal body of Salmonella typhimurium are composed of subunits of a single protein,FliF." J.Mol.Biol.227. 672-677 (1992)
• [文献書誌] 室谷 紘一: "ナノマシンアクチュエーターとしてのべん毛モータ" 最新医学. 47. 71-76 (1992)
• [文献書誌] 久堀 智子: "べん毛モータの菌体内構造形成" 細胞. 24. 16-21 (1992)
• [文献書誌] 月原 冨武: "超分子複合体のX線結晶構造解析" 蛋白質核酸酵素. (1993)
• [文献書誌] 月原 冨武: "分子置換法による球状ウィルスのX線結晶構造解析" 放射光. (1993)
• [文献書誌] 三木 邦夫(共著,日本生化学会編): "新生化学実験講座,第5巻「生体酸化・薬物代謝」" 東京化学同人, 432 (1992)
• [文献書誌] 三木 邦夫(共著,高分子学会編): "バイオ・高子分研究法5,「バイオ・高分子研究における物理〓歌計測とその応用」" 学会出版センター, 256 (1992)
• [文献書誌] 日本結晶成長学会編集委員会: "結晶成長ハンドブック" 共立出版株式会社, 800 (1993)
• [文献書誌] 美宅 成樹: "分子のひもの謎を解く-生体膜を作る力-" 裳華房, 141 (1992)
• [文献書誌] H.Nakayama,M.Taki, Y.Kanaoka: "Synthesis and properties of diazipine,A novel photoaffinity probeof dihydropyridine receptors. Methods in Pharmacol. vol.7(eds.H.Glossmann,J.Striessning)" Plenum Press,
• [文献書誌] 相沢 慎一(日本生化学会編): "「新生化学実験講座:第17巻微生物実験法」" 東京化学同人, (1992)