| 研究概要 |
腸管出血性大腸菌の産生するVoro毒素群は6種類(VT1,VT2,VT2vha,VT2vhb,VT2vp1,VT2vp2)が報告されており、酵素活性を持つAサブユニットと、結合に関与するBサブユニットからなる。これらVero毒素の作用機序は、RNA N-グリコシダーゼ活性により真核細胞の60Sリボソーム亜粒子内の28SrRNAの5'末端から4324番目のアデノシン残基のN-グリコシド結合を加水分解し、その結果、EF-1依存性アミノアシル-tRNA結合反応を阻害することがわかっている。
site-directed mutagenesis法を用いた変異導人法により活性中心部位を調べた結果、AサブユニットのN末端から167番目のグルタミン酸(E)と170番目のアルギニン(R)が重要であることがわかった。
E167Q(167番目のEをQに変えた変異体:以下同様の記述で変異体を示した),R170L,E167Q-R170L,野生型VT1を精製し、精製標品の細胞毒素を比較した。その結果、Vero細胞に対する活性は、E167QもE167Q-R170L,も野生型の1/3×10^5であり、蛋白合成阻害活性は野生型に比べ、E167Qが1/1×10^4以下、E167Q-R170Lが約1/3×10^3に低下していた。マウス致死活性ではLD_<50>がE167QもE167Q-R170Lも同程度で野生型の約1/1.5×10^3を示した。R170LではE167Q程の活性の低下はみられなかった。精製毒素を用いた今回の実験の結果は、すでに報告した粗毒素を用いた実験結果よりも変異毒素の活性低下が著しかった。167,170番目のアミノ酸の変異について両アミノ酸置換した変異体は167番目のEの単一置換体より活性低下が著しいことを期待していたが、期待したような相加、ないしは相乗効果はみれなかった。また、cell freeの蛋白合成阻害でのE167QとE167Q-R170Lの活性低下の差が細胞レベルでは緩和されていた。今後、変異型遺伝子をsuicide vectorに組み込み、宿主菌に戻し、生菌ワクチン株を得ることを試みたい。
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