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1991 年度 実績報告書

変異アルファ2プラスミンインヒビタ-の細胞内輸送障害の分子機構

研究課題

研究課題/領域番号 03454522
研究機関東京医科歯科大学

研究代表者

青木 延雄  東京医科歯科大学, 医学部, 教授 (20048937)

研究分担者 広沢 信作  東京医科歯科大学, 医学部, 講師 (50143574)
キーワードアルフア2プラスミンインヒビタ- / 細胞内輸送 / 欠損症 / 遺伝子変異 / α_2PIーOkinawa
研究概要

アルフア2プラスミンインヒビタ-(PI)のcDNAをpSV2ベクタ-に押入し発現ベクタ-を構築した。PI欠損の1家系にみられた3塩基欠損の見出された領域を含んだ制限酵素断片をM13に押入し、Kunkelのsiteーdirected mutagemesisの方法に從って、変異部位の周辺に種々の変異を作成し、dideoxy法によってシ-クエンスを行ない変異の有無を確認した。変異のかゝった断片を元の発現ベクタ-に組み込み、これらプラスミドDNAをCOS7細胞にトランスフェクション法にて導入し、発現実験を行った。細胞培養20時間後に、細胞抽出液および培養上清中のPIをELISAで測定し、またノ-ザンブロットで転写レベルを比較した。作成した変異ベクタ-は、合計30種に及んだ。もとのアミノ酸欠損部位を、他の種々のアミノ酸に置換した場合、発現量の低下はみられなかったが、培養上清中への分泌は、いずれも30ー50%の低下が見られた。置換したアミノ酸の疎水性や電荷と、分泌量との間には、何らの相関関係がみられなかった。次で、もとのアミノ酸欠損部位と異った部位にアミノ酸欠損を起こさせ、その影響を見た。すなわち、もとの欠損部位よりC末側に2アミノ酸づゝずれた位置にアミノ酸欠損を起こさせると、もとの欠損部位からの距離が遠くなるほど分泌への影響が無くなることが認められた。しかし発現量には全く影響はみられなかった。N末側に部位をずらしてアミノ酸欠損を起させた場合には、現在迄しらべた範囲内では、発現量には全く変化がみられず、分泌量は、もとの欠損部位より新しい欠損部位が遠くなるほど若干の回復傾向が見られたが、C末側で見られたような著しい回復は、現在のところみられていない。さらに欠損部位をN末側に移動させて発現実験を行い、アミノ酸欠損による分泌量低下が、どの範囲の領域のアミノ酸欠損によって起るものかを決定する。

  • 研究成果

    (5件)

すべて その他

すべて 文献書誌 (5件)

  • [文献書誌] Shinichi Ohdama: "Pentoxifyline prevents tumor necrosis factorーinduced suppresion of endothelial cell surface thrombomadulin" Thrombosis Research. 62. 745-755 (1991)

  • [文献書誌] Kazuteru Ohashi: "The biosynthesis of thrombomadulin and its enhancement by dibutyryl cAMP in a human megakaryoblastic cell tine,UTー7" International Journal of Hematology. 54. 341-349 (1991)

  • [文献書誌] Kazunori Hirokawa: "Regulatory Mechanisms for thrombomadulin expression in human umbilical vein endathelial cells in vitro" Journal of Cellular Physiology. 147. 157-165 (1991)

  • [文献書誌] Kazunori Hirokawa: "Upーregulation of thrombomodulin by activation of histamine H_1ーreceptors in human umbilicalーvein endothelial cell in vitro" Biochemical Journal. 276. 739-743 (1991)

  • [文献書誌] Takatoshi Koyama: "Relationship between postーtranslational glycosylation and anticoagulant function of secretable recanbinant mutants of human thrambomodulin" British Journal of Haematology. 78. 515-522 (1991)

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公開日: 1993-03-16   更新日: 2016-04-21  

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