時分割X線結晶解析によるグルタチオン合成酵素の動的構造研究

1992 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 04044103
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 勝部 幸輝 大阪大学, たんぱく質研究所, 教授 (20032013)
• 研究分担者: J Hajdu 英国オックスフォード大学, 分子生物学科, 講師 ; G Petsko 米国ブランダイス大学, 基礎医科学研究センター, 教授 ; 加藤 博章 京都大学, 化学研究所, 助手 (90204487) ; 畑 安雄 京都大学, 化学研究所, 助教授 (10127277) ; 西岡 孝明 京都大学, 化学研究所, 助教授 (80026559) ; 小田 順一 京都大学, 化学研究所, 教授 (50027041)
• キーワード: 時間分割結晶構造解析 / グルタチオン合成酵素 / ラウエ法 / 放射光 / フローセル / フラッシュ光反応 / 変異体酵素 / ATP

研究概要

本研究のために蛋白質工学的手法によって作製したグルタチオン合成酵素の人工変体のうち、生化学的および結晶学的予備研究の結果、最も成果が期待されると思われたループ欠損型およびR210K変異体の2種類の結晶について、白色X線(波長0.5〜2.5A^° )を用いたラウエ法の測定条件を、米国ブルックヘブン国立研究所および英国ダラスベリ放射光実験施設で検討した。ループ欠損型酵素については、フローセルを用いて基質ATPとγ-Glu-Cys(いずれも50mM)を流しながら、酵素反応の進行過程での酵素および基質などの構造変化を観測するために、結晶の固定剤、基質緩衝液の組成、反応温度について検討した。その結果、結晶をSephadex G-25superfineで固定し、基質を含むトリス塩酸暖衝液を0℃でゆっくりと流しながら、0、25、50、75°の各スピンドル角で、経時的にラウエ反射を測定(露出時間約150分)することにした。結晶には、外見上、何らの変化も認められなかったが、各ラウエ回折斑点付近にストリークが観測された。これは、結晶中の酵素4量体分子の充填状態が酵素反応の進行の伴って若干変化し、結晶のモザイシィが変化したことによるものと思われる。今後、ループ欠損型酵素の動的構造を、時間分割ラウエ法によって知るためには、さらなる短時間測定技術の開発が心要となるものと思われる。また、R210K変異体酵素とcaged-ATP複合体結晶にflash照射を10回行ってphotolysisによるATPの生成を吸収スペクトルで確認後、直ちにラウエ測定を開始した。室温で188分後まで経時的に測定を行ったところ、ストリークのない良好なラウエ像が得られた。これは、十分に本研究目的に合致する成果が期待できる結果で、現在、このデータ処理を行っている。

研究成果

• [文献書誌] Y.KATSUY,M.SATO,Y.KATSUBE,Y.MATSUURA,K.TOMODA: "Small-angle X-ray Scattering Study of Metal Jon-induced Canformational Changes in Serratice Protease" J.Biol.chem.267. 12668-12672 (1992)
• [文献書誌] M.SATO,M.YAMAMOTO,K.IMADA,Y.KATSUBE,N.TANAKA,T.HIGASHI: "A High-Speed Data-Collection System for Large-Unut Cell Crystals asing an Imaging Plate as a Detector" J.App.Cryst.25. 348-357 (1992)
• [文献書誌] M.SAKIRAI,K.ONODERA,H.MORIYAMA,O.MATSUMOTO,N.TANAKA,M.SATO,Y.KATSUBE,T.OSHIMA: "Crstallization and Preliminary X-ray Studies of A B.sicdtilis and T.ther mophilus HB8 Chimeric 3-IPMDH and Thermostable Mutants of It." J.Biochem.112. 173-174 (1992)
• [文献書誌] B.MIKAMI,M.SATO,T.SHIBATA,M.HIROSE,S.AIBARA,Y.KATSUBE,Y.MORITA: "Three-Dimensional Structure of Soybean β-Awy lase Determined at 3.0Å Resobution:Prelimiory Chaiu Tracing of the Couplex coith d-Cyclodextrin." J.Biochem.112. 541-546 (1992)
• [文献書誌] M.SATO,Y.KATSUBE,M.KATAI,J.KATAKAWA,T.TETSOMI: "Crystcal and Molecular Structare of 3,6-Dioxograyanotoxin I" Bull.Cheu.Soc,JAPAN. 65. 2836-2838 (1992)
• [文献書誌] H.YAMAGUCHI,H.KATO,Y.HATA,T.NISHIOKA,A.KIMURA,J.ODA,Y.KATSUBE: "Three-Dimensional Structure of the Glutathione Synthe Tase from E.coli Bat 2.0Å Resolution" J.Mol.Biol.230. -18 (1993)
• [文献書誌] C.Branden,J.Tooze著 監修 勝部幸輝.松原央.松原謙一 翻訳 勝部幸輝.竹中章郎.福山恵一.松原央: "タンパク質の構造入門(Introduction to Protein Structure)" 教育社, 285 (1992)