遺伝子標的組み込みによる疾患モデルマウスの作製

1992 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 04454170
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 島田 和典 大阪大学, 微生物病研究所, 教授 (40037354)
• 研究分担者: 西口 聖治 大阪大学, 微生物病研究所, 助手 (90237686)
• キーワード: 遺伝子標的組込み / 相同組換え / ジーンターゲティング / ES細胞 / F9細胞 / トランスサイレチン / モデルマウス / 遺伝病

研究概要

胚性幹細胞(ES)と相同DNA間の組換えを利用して疾患モデルマウスを作製する方法の確立を目指し、家族性アミロイドポリニューロパチー(FAP)を取り上げている。FAPは、1アミノ酸置換した異型トランスサイレチン(TTR)が全身臓器にアミロイドとして沈着し、末梢神経障害、自律神経障害をきたす常染色体優性の難病である。我々は既に、相同DNA間の組換えを利用したトランスサイレチン(TTR)欠損マウスの作製に成功しているが、より効率の良い変異導入用ベクターを開発するために、挿入変異導入用ベクターのDNA構造を検討した。標的遺伝子にはマウスttr遺伝子を用い、受容細胞には、ES細胞に性質が類似し、培養のより容易なF9細胞を用いた。試作した挿入変異導入用ベクターは、マウスttr遺伝子の5'-flanking領域から第3イントロンにわたる5.9kbのDNA断片の第2エクソンにG418耐性遺伝子(neo)を挿入し、3'末端に単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子(HSV-tk)遺伝子を接続したもので、このベクターを基本構造として以下の知見を得た。
1)ベクター線状化後にHSV-tk遺伝子に連結しているplasmid領域が長いほどGANCによる濃縮効果は高まった。
2)GANC耐性の非相同組換え株から任意に20株選び、それらのゲノム構造をHSV-tkの遺伝子を中心としてサザンブロット法で解析したところ、19株ではHSV-tkの遺伝子の一部、または全体が、ベクター末端から順次欠失した構造をとっていた。
3)neo遺伝子とHSV-tk遺伝子の間の相同領域の長さを短縮したところ、それに伴いGANCによる濃縮効果が上昇したが、それ以上に相同組換え頻度の低下の方が著明であった。
4)HSV-tk遺伝子をベクターの両端に連結してもGANCによる濃縮効果は高まらなかった。

研究成果

• [文献書誌] Murakami,T.: "A novel transthyretin mutation associated with fanilial anyloidotic polyneuropathy" Biochem.Bioph.Res.Comn.182. 520-526 (1992)
• [文献書誌] Murakami,T.: "Effect of serum amyloid P component level on transthyretin-derived amyloid deposition in a transgenic mouse model of familial amyloidotic polyneuropathy" Am.J.Pathol.141. 451-456 (1992)
• [文献書誌] Qiu,H.: "Chromosomal localization of the mouse prealbumin gene(Ttr) by in situ hybridization" Cytogenet.Cell.Genet.61. 186-188 (1992)
• [文献書誌] Episkopou,V.: "Disruption of transthyretin gene results in mice with depressed levels of plasma retinol and thyroid hormone" Proc.Natl.Acad.Sci.USA. (1993)
• [文献書誌] Yamamura,K.(共著): "Molecular Approaces to the Study and Treatment of Human Diseases(Analysis of the pathological process of dominant disease:familial amyloidotic polyneuropathy)" Elsevier Science Publishers B.V.Yoshida,T.O., and Wilson,J.M. eds., 8 (1992)