| 研究課題/領域番号 |
04454170
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
島田 和典 大阪大学, 微生物病研究所, 教授 (40037354)
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| 研究分担者 |
西口 聖治 大阪大学, 微生物病研究所, 助手 (90237686)
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| キーワード | 相同組換え / モデルマウス / トランスサイレチン / F9細胞 / メチル化 / 遺伝子標的組み込み / 遺伝病 / ジーンターゲティング |
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| 研究概要 |
疾患モデルマウスの作製に必須で、かつ現時点では困難な技術である、遺伝子への点変異導入法を検討した。点変異により家族性アミロイドポリニューロパチー(FAP)の病因になるトランスサイレチン(ttr)遺伝子を用いて、以下のベクターを構築した。5.9kbのttr遺伝子断片の第2エクソンにFAP患者と同一の点変異を導入し、G418耐性遺伝子および単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ(HSV-tk)遺伝子の2つの選択マーカーを、第2イントロン内に挿入した。さらに、選択マーカー上流に隣接した3kbの領域をさらにマーカー下流にも配置して、繰り返し構造にした。ベクターをマウス胚性腫瘍細胞株F9へ導入後、ttr遺伝子と相同組換えを起こした株をG418耐性株から単離し、その後の培養過程で繰り返し配列間での組換えでマーカーを失い点変異のみが導入された株を、ガンシクロビール耐性株から単離した。ベクターとttr遺伝子との組換え頻度は、以前に行ったttr遺伝子のknockout実験とほぼ同一であり、ベクター内に繰り返し配列が存在しても、相同組換え頻度は低下しないと考えられた。繰り返し配列間での組換え株の選択では、プロモーター領域のメチル化によるHSV-tk遺伝子の不活化が、選択効率を低下させる最大の要因であることがわかり、今後、プロモーターを改良することで、より効率を高められる可能性が示唆された。繰り返し配列間での組換えは、ttr遺伝子領域のみならず、ベクターDNAをゲノムの任意の部位に挿入した5つの株でも認められ、本手法が種々の遺伝子座に応用可能なことが示された。
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