| 研究課題/領域番号 |
04557024
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
西渕 光昭 京都大学, 医学部, 助教授 (50189304)
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| 研究分担者 |
高野 純 島津製作所, 技術研究本部中央研究所, 主任研究員
倉園 久生 京都大学, 医学部, 助手 (90186487)
竹田 美文 京都大学, 医学部, 教授 (30029772)
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| キーワード | 食中毒原因細菌 / 腸炎ビブリオ / 病原大腸菌 / 黄色ブドウ球菌 / エンテロトキシン遺伝子 / PCR法 / DNA増幅法 |
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| 研究概要 |
食中毒原因細菌のDNA増幅法(PCR法)による検出のために本研究で採用したアプローチが適切であることを、まず腸炎ビブリオ菌株について実証した。病原性菌株は、耐熱性溶血毒遺伝子(tdh)に限定できず、tdh類似遺伝子(trh)を持つ可能性があり、しかもtrh遺伝子の塩基配列にバラツキが多いことを確認した。tdh遺伝子とtrh遺伝子検出用のPCRプライマーセットを、それぞれ7組と5組デザインし、増幅条件を比較検討した。最終的に263菌株を対象として、標的遺伝子をもれなく検出できるプライマーセットと増幅条件を得た。すなわち、このPCR法で得られた結果は、ポリヌクレオチドプローブを用いたハイブリダイゼーション法による標的遺伝子の検出結果と完全に一致した。また40種におよぶ他の細菌133菌株は、このPCR法では陰性であり、特異性が確認できた。
同様の方法で、病原大腸菌の耐熱性エンテロトキシンと易熱性エンテロトキシンおよび黄色ブドウ球菌の各種エンテロトキシンの遺伝子検出のためのPCRプライマーと増幅の条件を確立した。
さらにPCR産物の新しい検出法を開発した。この方法では、PCR産物をビオチンで標識して、アフィニィティ法によりマイクロタイタートレーの穴にトラップする。これを非アイソトープ(アルカリフォスファターゼ)標識したオリゴヌクレオチドプローブを用いて検出する。数コピーの標的遺伝子を所用時間45分で検出でき、今までに報告された方法の中で最も速いことがこの方法の最大の特長である。
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