| 研究課題/領域番号 |
07405060
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| 研究種目 |
一般研究(A)
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
今西 幸男 京都大学, 工学研究科, 教授 (00025991)
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| 研究分担者 |
伊藤 嘉浩 京都大学, 工学研究科, 助教授 (40192497)
木村 俊作 京都大学, 工学研究科, 助教授 (80150324)
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| キーワード | タンパク質工学 / 遺伝子工学 / リゾチーム / エステラーゼ / tRNA / 人工酵素 / ポリプロリン / 非天然アミノ酸 |
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| 研究概要 |
天然アミノ酸の非天然配列を遺伝子工学的に天然酵素に導入し、新しい人工酵素を合成しようとする試みと、非天然アミノ酸を部位特異的に天然酵素へ導入する試みを行った。
1. 天然酵素としてリゾチームを選び、そのカルボキシル末端にポリプロリンを導入した。ポリプロリンの残基数を、10、20、30、40と増加させると活性は減少し、1/10程度になったが、残基数の増加に従い疎水性が増加することが、疎水性クロマトグラフにより明らかになった。また、ポリプロリン導入によりリゾチームの構造はあまり変化をうけていないことが、円偏向二色性測定によりわかった。また、ポリプロリン結合リゾチームはエタノール/水混合系でも活性を保ち、耐熱性も向上した。
2. 非天然アミノ酸でアシル化してサプレッサーtRNAを合成し、これをストップ・コドンを予め導入しておいたDNAとリボソーム系に加え、ストップコドンの部位に非天然アミノ酸を導入することを考えた。まず、非天然アミノ酸を担持したtRNAを効率よく合成するための方法を種々考案した。まず、アシル化ATPを合成し、これを基質としてRNAポリメラーゼを働かせ、末端にアシル化アデニンを有するRNAセグメントを合成した。一方で、通常のATPを用いて合成したRNAセグメントを合成し、両者をライゲーションして、アシル化tRNAを合成した。このように合成したtRNAを用いたタンパク質合成を現在検討中である。
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