CカイネースによるNaチャネル発現の制御と細胞応答の修飾

1995 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 07670114
• 研究機関: 宮崎医科大学
• 研究代表者: 和田 明彦 宮崎医科大学, 医学部, 教授 (30131949)
• 研究分担者: 山本 隆一 宮崎医科大学, 医学部, 助手 (10094111) ; 占部 正信 宮崎医科大学, 医学部, 助手 (00094087) ; 小林 英幸 宮崎医科大学, 医学部, 助教授 (40148953)
• キーワード: Sodium channel / Protein kinase C / Down-regulation / Western blot / Northern blot / Binding / ^<22>Na+ influx / Gene expression

研究概要

ウシ副腎髄質細胞(発生学時に神経堤に由来し、交感神経節と相同)の培養系において、プロテイン・カイネースCが細胞膜Naチャネル発現とその薬理学的性質を、どのように変動させるか検討した。
1.プロテイン・カイネースC活性薬TPA、PDBuで細胞を処理すると、濃度依存的(lC_<50> 19nM)、時間依存的(T1/2 4.5h)に、^3H-サキシトキシン結合のB_<max>が減少した(K_dは不変)。生物学的活性を示さない4α-TPAは効果がなく、また、TPAの作用はプロテイン・カイネースC阻害薬H-7、アクチノマイシンD、サイクロヘキサマイドなどの遺伝子転写、翻訳阻害薬により消失した。
2.ウエスタン・ブロットにおいて、TPA(100nM)、PDBu(100nM)で15h処理した際には、α-、ε-サブタイプは細胞質より膜分画ヘ移行した(ζ-サブダイプは移行しない)。
TPA処理細胞では、Naチャネル活性薬ヴェラトリジンの細胞内への^<22>Na+流入の濃度-作用曲線は下方に移動した(EC_<50>は不変)。また、ヴェラトリジンの^<22>Na^+流入は、対照細胞と同程度、ブレベトキシンによってアロステリックに増強された。
ノーザン・ブロットにより、ウシ副腎髄質細胞mRNAは、ラット脳タイプII、II^ANaチャネルcDNAプローブとは、ハイブリダイズしなかった。心臓、骨格筋のNaチャネル間で相同性の高い領域を選び、RT-PCRによりプローブを得たが、これともハイブリダイズしなかった。ヒト神経内分泌細胞型NaチャネルcDNAプローブ(1.5Kb、2.2Kb)では、9.5Kbにバンドが検出された。
以上、(1)副腎髄質細胞Naチャネルは、分子構造の点で、神経内分泌型Naチャネルに類似していること、(2)α-、ε-サブタイプのプロテイン・カイネースC活性化によりdown-regulationされるが、その薬理学的性質は変化しないこと、(3)down-regulationには、蛋白質のde novo合成が関与していることを、明らかにした。

研究成果

• [文献書誌] 柳田俊彦: "ウシ副腎髄質細胞の電位依存性NaチャネルmRNA" 第69回日本薬理学会年会予稿集. 0040 (1996)
• [文献書誌] 由比友顕: "副腎髄質電位依存性Na channel蛋白の発現調節;cAMP及びTPAによるdual-regulation" 第69回日本薬理学会年会予稿集. 0404 (1996)
• [文献書誌] Yanagita Toshihiko: "Protein kinase C-mediated down-regulation of voltage-dependent sodium channels in adrenal chromaffin cells." Journal of Neurochemistry. (accepted for publication Oct 9). (1996)
• [文献書誌] Yanagita Toshihiko: "Down-regulation of functional voltage-dependent sodium channels by protein kinase C in adrenal medulla." Journal of Neurochemistry. 65(Suppl). S160 (1995)
• [文献書誌] Yanagita Toshihiko: "Role of protein kinase C isoforms in the regulation of the voltage-dependent sodium channels in adrenal chromaffin cells." Society for neuroscience 1995 abstract. 21. 716.2 (1995)
• [文献書誌] 和田明彦: "副腎クロマフィン細胞の電位依存性Na^+チャネル" 岡崎国立生理研研究会「内分泌細胞とニューロンの相互移行、クロム親和性細胞を中心に」. (1995)
• [文献書誌] Yanagita Toshihiko: "Protein kinase C and down-regulation of voltage-dependent Na channel in bovine adrenal medulla cells." Japanese Journal of Pharmacology. 64(Suppl 1). 457 (1994)
• [文献書誌] Wada Akihiko: "Down-regulation of voltage-dependent sodium channel and protein kinase C in cultured bovine adrenal medullary cells." Japanese Journal of Pharmacology. 61(Suppl 1). 286 (1993)