| 研究概要 |
グルタチオン生成の律速段階としての位置を占め、酸化的ストレスからの細胞保護において重要な役割を果たすシスチン・グルタミン酸交換輸送担体の構造、機能的特徴、発現の組織分布を明らかにするために、Xenopus卵母細胞発現系を用いた発現クローニングを行った。出発材料選定のために、ラット脳、C6グリオーマ細胞、ジエチルマレイン酸で処理したマウス腹腔マクロファージ、及び培養マクロファージ細胞株のpoly(A)^+RNAをXenopus卵母細胞に発現させ、^<14>C-シスチンの取り込みを比較したところ、ジエチルマレイン酸処理腹腔マクロファージ及び培養マクロファージ細胞株が安定した同程度の取り込みを示したため、大量のpoly(A)^+RNAが容易に得られる培養マクロファージ細胞株を発現クローニングの出発材料として用いることを最終的に決定した。ジエチルマレイン酸で処理したマクロファージ細胞株より抽出したpoly(A)^+RNAを分取用ゲル電気泳動により分画を行い、Xenopus卵母細胞に発現させることにより2.0-3.0kbに、シスチン・グルタミン酸交換輸送担体機能の指標となるL-α-アミノアジピン酸及びグルタミン酸によって抑制される、^<14>C-シスチンの取り込み活性の高い画分が存在することがわかった。この画分よりGubler & Hoffman法によりcDNAを合成し、プラスミド pSPORT1のSall/NotI部位にライゲートすることにより発現プラスミドライブラリーを作製した。300-500クローンを一グループとして、in vitro転写によってcRNAを得、Xenopus卵母細胞に発現させることにより^<14>C-シスチンの取り込みを指標にスクリーニングを行った。約3,000クローンのスクリーニングでは目的のクローンは得られていないため、さらに平成8年度に継続してスクリーニングを行う。cDNA単離に続き、一次構造、発現の組織分布の決定、Xenopus卵母細胞を用いた機能解析を行う。
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