| 研究課題/領域番号 |
08559016
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| 研究種目 |
基盤研究(A)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 展開研究 |
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| 研究分野 |
広領域
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| 研究機関 | 国立医薬品食品衛生研究所 |
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研究代表者 |
井上 達 National Institute of Health Sciences, Division of cellular and molecular toxicology, director -> 国立医薬品食品衛生研究所, 安全性生物試験研究センター・毒性部, 部長 (50100110)
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| 研究分担者 |
相賀 裕美子 国立医薬品食品衛生研究所, 安全性生物試験研究センター・毒性部, 室長 (50221271)
平林 容子 国立医薬品食品衛生研究所, 安全性生物試験研究センター・毒性部, 主任研究官 (30291115)
高木 篤也 国立医薬品食品衛生研究所, 安全性生物試験研究センター・毒性部, 主任研究官 (00179417)
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| 研究期間 (年度) |
1996 – 1998
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| キーワード | 胚幹細胞 / 発生傷害 / 遺伝子突然変異 |
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| 研究概要 |
本研究では、ES細胞を用いた遺伝子突然変異を検出系の樹立を目的に研究を行った。突然変異検出遺伝子として、大腸菌のgpt遺伝子を導入した。一方、マウスの内在するhprt(hypoxanthine phosphoribosyl transferase)遺伝子の存在が突然変異検出の障害となる。そこでhprt遺伝子が欠失したマウスES細胞株を使用した。大腸菌のgpt遺伝子を含むプラスミド(psv2-gpt)をエレクトロポーション法を用いて導入した。HAT選択培地として、通常のES用倍地から、ヌクレオシドを除いたものに120μMのhyoxanthine、0.4μMのaminopterin、20μMのthymidineを加えたものを使用し、10μg/mlのmycophenolic acidおよび185μM adenineを添加した。培養2週間後、薬剤耐性コロニーの出現が認められ、最終的に5個のESクローンを得ることが出来、PCRでも遺伝子導入を確認した。6-チオグアニン存在下での自然突然変異頻度は10^6当たり1個程度であった。さらに、この5クローンの中から変異原物質に感受性の高いものを選ぶためMMS(15μg/ml medium,6hrs)を添加し、6TG耐性のクローンを計測した結果、最も高いもので24個(突然変異コロニー)/10^5ES細胞であった。以上の結果、高感度かつ簡便なES細胞の突然変異検出系を樹立することが出来た。
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