| 研究概要 |
In situ PCRでは,細胞の形態を保存しかつPCR試薬を細胞内に到達させるために,予め固定後の細胞をプロテアーゼで適度に消化して核膜を穿孔するとともにDNAを露出しておくことが必要である.In situ PCRによるHLA-DQα型判定を行うための予備実験として,採取の容易な口腔粘膜細胞を使い,Y染色体上のSTR座DYS389IIをマーカーとして,微量試料のIn situ PCRのための至適前処理条件を検討した.
口腔粘膜細胞は消化しにくく,固定後さらに消化困難になることがわかったため,未固定口腔粘膜細胞を用いた.綿棒で採取した口腔粘膜細胞を洗浄し,プロテイネースKで10〜30分間55℃で消化した後,沸騰水溶中で酸素を失活させ,これを鋳型としビオチン標識プライマーを用いてDYS389IIをPCR増幅した.PCR終了後,細胞を洗浄して,アルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジンで増幅産物を検出した.
男性サンプルでは,10分間消化した場合,核のみが染まる典型的な陽性細胞の他に,細胞質まで染まる細胞やまったく染まらない細胞が認められた.消化時間を延ばすと陽性率が低下することから,これらの細胞では,消化過剰のため増幅産物が核内から細胞質に拡散し,さらには細胞外に流出したと考えられる.この結果は,In situ PCRの全過程のうち,プロテイネースKによる消化が最も重要な段階であることを示す.女性サンプルでは,消化時間の長さに関係なく発色は認められなかった.
現在,サンプル内での消化を均一にして再現性を高めるため,スライドグラスに塗抹した口腔粘膜細胞を用いて検討を進めている.
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