| 研究概要 |
1,RT-PCRに必要なprimerを、src DNA exon3,eson4にそれぞれデザインし、合成した。デザインは、コンピューターを用いて行い、c-srcN2ha196bp、c-sfcN1は、163bp、c-srcは145bpのproductsとなる様にした。
2,神経芽腫細胞株RT-BM-1を用い、PCRの予備実験を行った。PCR productsは予測されるサイズに、5% アガロースゲルの上で分離、同定された。exon3に存在するHinc II siteを利用して、PCR productsを消化したところ、予測される制限酵素切断パターンをとった。また、PCR products をナイロンフィルターに移りとり、我々がクローニングしたヒト src cDNAをプローブにSouthern blot hybridezation を行ったところ、強いシグナルが得られ、PCRの特異性も確認できた。
3,PCRの最適反応条件を決定した後、増幅回数を多段階に設定し、PCR productsの指数的増幅が得られる条件を確定した。PCR prodectsの定量はKodak digital science DC40 camera と 1D Image Analysis Application program(Eastman Kodak,Rochester,NY)にて行った。10種類の神経芽腫細胞株ならびに、神経芽腫細胞株RT-BM-1のレチイノン酸分化誘導前後の状態においての3種類のsfc mRNAの発現を、Slnuclease protection asay と RT-PCRで比較したところ、両実験系はよく相関し、RT-PCRの定量性を確認することができた。
神経芽腫
|
