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アリールスルファターゼ(Ars)遺伝子の第一イントロン内のC15領域には、Otx認識配列が2個反復しており、2種類のOtx蛋白質(OtxE、OtxL)が結合し、エンハンサー活性を担っている。本年度は以下の研究を行った。
1.Otx蛋白質と相互作用する蛋白質の精製・生化学的解析・・・Otx認識配列の合成DNAを用いたアフィニティカラムにより、ウニ胚核抽出液からOtx蛋白質と相互作用する蛋白質の精製を試み、複数の蛋白質を検出した。
2.Ars遺伝子の転写活性に影響を及ぼすOtx以外の蛋白質因子群の解析・・・・・Otx認識配列のみをシスエレメントとして連結したレポーター遺伝子をウニ受精卵に導入したが、エンハンサー活性は低く、Otxは転写活性化には重要であるが、単独では強いエンハンサー活性を持ち得ないことが示された。C15領域を更に詳細に検討したところ、Otx認識配列とその両側のCAAT認識配列の両方が存在し場合に強いエンハンサー活性を担うことが示された。両者に結合しうる因子の解析を行っている。
3.OtxE、OtxLの機能解析と機能部位結合蛋白質のcDNAクローニング・・・・・(1)OtxE、OtxL各アイソフォームのmRNAのウニ胚での強制発現は、間充織細胞及び原腸の陥入と口側・反口側軸の決定を阻害し、外胚葉のみからなる球状の胚を形成した。各アイソフォームの三胚葉における発生段階・組織特異的な発現は、初期発生における形態形成において重要であると考えられる。又、OtxEの強制発現はOtxLの発現を促進し、OtxLの強制発現はOtxEの発現を抑制し、相互に影響しあっていた。(2)UAS-C15融合エンハンサーの系を用いた各アイソフォームの欠失蛋白質によるトランスアクティベーションアッセイは、C末側が他の因子と相互作用し、Ars遺伝子の転写活性化を行う可能性を示した。(3)機能部位に結合する蛋白質のcDNAのクローニングを現在two-hybrid法により行っている。
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