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凝固第VIII因子の遺伝子異常により発症する血友病Aでは、主にウイルスベクターを用いた遺伝子治療法の開発が進められてきたが、抗ウイルス抗体の出現や癌化の懸念などが払拭できない。本研究では、安定に自律複製するヒト人工染色体(HAC)ベクターを用いて、高性能な遺伝子組換え製剤および安全性の高い遺伝子治療法を開発することを目的とし、当該年度は、マウスiPS細胞にVIII因子搭載人工染色体(FVIII-HAC)を導入し、キメラマウスを用いた発現解析を行った。また、in vitroにおける分化系を確立し、構築したベクターのVIII因子発現レベルを評価した。
VIII因子に対する中和抗体産生の抑制を期待し、血小板特異的にVIII因子を発現させるためにPlatelet factor 4 (PF4)プローモーターを選択し、その下流にVIII因子遺伝子を配置した発現カセットをタンデムに4コピー搭載したHACベクターを微小核細胞融合法によりiPS細胞に移入した。このFVIII-HACが宿主染色体とは独立に保持されていることを蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)解析により確認した。さらに、iPS細胞を用いてキメラマウスを作製し、VIII因子の発現解析を行った。種々の臓器のRT-PCRの結果、骨髄においてのみVIII因子の発現が認められた。また、骨髄細胞および血小板の免疫染色の結果より、IIb/IIIa陽性細胞すなわち巨核球/血小板のうち、一部の細胞でGFP陽性(HACベクター上にはGFPが搭載されている)細胞が見られ、その細胞においてはすべてVIII因子の発現が認められた。他方、iPS細胞をIn vitroにおいて巨核球/血小板へ分化誘導し、本ベクターの有用性をトロンビン合成基質法により検討したところ、機能的なVIII因子の発現が確認できた。上記のほか、マウスを用いた本治療法の有効性の検証を行うため、同様のVIII因子発現カセットを4コピー搭載したマウス人工染色体ベクター(FVIII-MAC)も構築した。当該年度の研究で、巨核球/血小板特異的にVIII因子を発現する有用なFVIII-HACベクターの構築に成功した。
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