|
当研究では、哺乳類の「小胞体ストレス応答」を制御する中心的な因子である「XBP1」の活性化機構の全容を明らかにすることを目的としている。前年度までにyeast two-hybrid screeningによってXBP1に結合する因子としてUBC9(SUMO化経路のE2酵素)とRHA(クロマチンリモデリング因子)を単離した。これらの因子がXBP1の発現にどのように関わっているか調べるために本年度は以下の実験を行った。
UBC9がXBP1の分解を制御しているのではないかという仮説を検証するため、XBP1のみを導入した細胞とXBP1とUBC9を導入した細胞でXBP1の分解速度を比較した。その結果、両者間に大きな差は見られなかった。この実験は導入した遺伝子量の割合や細かい時間で分解速度を調べる必要があるなど改善の余地があるため、引き続き実験を行う予定である。また、小胞体ストレスの有無によってUBC9の局在が変化する可能性を検証するために、MycタグをつけたUBC9を導入した細胞を用いて小胞体ストレス条件下でのUBC9の経時的な局在変化を蛍光観察で調べた。その結果、有意な変化は見られなかった。また、小胞体ストレスをかけた細胞と小胞体ストレスをかけていない細胞をそれぞれ核画分と細胞質画分に分けて内在性UBC9の局在変化を調べたが、顕著な差は見られなかった。小胞体ストレスの有無でXBPIとUBC9の結合力に違いがある可能性を検証するため、XBP1とGSTを導入した細胞とXBP1とGSTが繋がったUBC9を導入した細胞に小胞体ストレスをかけてpull down assayを行った。その結果、両者間の差は検出されなかった。次年度は免疫沈降法によって小胞体ストレスの有無による結合力の差を調べる予定である。RHAに関しては、小胞体ストレスの有無によって細胞内のRHA量は変化しないことがわかった。今後はUBC9と同様に小胞体ストレスによる局在変化が起こっていないか調べ、RHAの発現を抑制することでXBP1による転写が促進するか調べたい。
|
