| 研究概要 |
本年度は、細菌の1,2-α-マンノシダーゼ遺伝子のクローニングと発現を行った
1、1,2-α-マンノシダーゼ遺伝子のクローニング; Bacillus sp.M-90のゲノムDNAをSau3AIで部分消化した断片をベクターに組込んだゲノムライブラリーより、コロニーハイブリダイゼーションにより、本酵素遺伝子のクローンを得た。
2、大腸菌における発現; 上記クローンより、遺伝子全長を含むものを作成し、これを有する大腸菌を培養し、菌体破壊後、可溶性画分より酵素を調製した。
3、塩基配列の決定; 1,2-α-マンノシダーゼ遺伝子(aman2)は全長5928ヌクレオチドで、1976アミノ酸をコードしていた。Hydropathy plotより、開始Metから37アミノ酸が分泌のシグナル配列であると推定された。aman2は遺伝子およびアミノ酸配列の相同性検索で既知の配列と相同性のあるものはなかった。
4、リコンビナント酵素の性質; aman2を大腸菌で発現させ、菌体破壊後可溶性画分より酵素を単離し性質を調べた。SDS-PAGEでNativeな1,2-a-マンノシダーゼト同位置にタンパクバンドが検出され、Native酵素の抗体ともクロスした。N末端アミノ酸配列もNative酵素と一致した。ゲル濾過分析で分子質量38万の位置に活性が溶出されたことで、リコンビナント酵素もNativeな酵素と同様に分子質量19万のサブユニットからなる2量体を形成していることがわかった。
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