神経線維腫瘍2型(NF2)癌抑制遺伝子のプロモーター領域の発癌機構への関与

2000 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 11671371
• 研究機関: 鹿児島大学
• 研究代表者: 竹島 秀雄 鹿児島大学, 医学部・附属病院, 講師 (70244134)
• 研究分担者: 倉津 純一 鹿児島大学, 医学部, 教授 (20145296) ; 生塩 之敬 熊本大学, 医学部, 教授 (20028583) ; 西 徹 熊本大学, 医学部・附属病院, 助手 (00264309)
• キーワード: NF2 / gene / promoter / cloning / luciferase / methylation

研究概要

神経線維腫症2型(NF2)関連腫瘍においてNF2遺伝子の蛋白質コード領域に遺伝子変異のない約半数の腫瘍の発癌機序を解明するために、NF2遺伝子のプロモーター領域を解析した。まず、BACヒト遺伝子ライブラリーからプロモーター領域を含むクローンをスクリーニングし、単離した。DNAシークエンス解析により塩基配列を決定したところNF2のプロモーター領域はTATAボックスを欠き、GC含量が高く、複数の転写開始点を有する典型的なハウスキーピング遺伝子プロモーターの特徴を有していた。次に、プロモーター領域の様々な欠失変異体を作成し、ルシフェラーゼ・アッセイにより、翻訳開始コドンより-616〜-550の約70bpの領域(cis-acting region)がNF2遺伝子の転写に必須であることを見いだした。同部は、CpG islandの5'上流に位置しており、領域内に含まれるCpG siteは5カ所のみであった。ゲルシフトアッセイでは、cis-acting regionと核タンパク質がDNA-タンパク質複合体を形成し、その結合には70bpのほぼ全体が必要であること、またその結合配列および様式の特異性から新しい転写因子である可能性が示唆された。
実際の神経鞘腫症例においてcis-acting regionの遺伝子異常を解析したところ、25例中プロモーターの遺伝子変異は1例も認めず、遺伝子変異の頻度は低いものと考えられた。一方、過半数の症例においてCpG配列の部位特異的メチル化を認め、メチル化はNF2 mRNAの発現レベルとよく相関していた。また、cis-acting regionの部位特異的メチル化や遺伝子変異導入により、ゲルシフトアッセイでDNA-タンパク質複合体の結合が阻害された。以上のことより、NF2の発癌機構においてプロモーター領域のメチル化が(あるいは頻度は低いものの遺伝子変異が)重要な役割を果たしているものと考えられた。

研究成果

• [文献書誌] Yamamoto K, et al: "Cloning and functional characterization of the 5'-flanking region of the human monocyte chemoattractant protein-l promoter (CCR2) gene."J Biol Chem. 274. 4646-4654 (1999)
• [文献書誌] Takeshima H, et al: "Identification and characterization of the cis-regulatory element in NF2 gene promoter that is inactivated by methylation in vestibular schwannomas."Neuro-Oncology. 1. S76 (1999)
• [文献書誌] Goto T, et al.: "High efficient electro-gene therapy of solid tumor by using an expression plasmid for the herpes simplex virus thymidine kinase gene."Proc Natl Acad Sci USA. 97. 354-359 (2000)
• [文献書誌] Takeshima H, et al.: "Application of advances in molecular biology to the treatment of brain tumors."Current Oncology Reports. 2. 425-433 (2000)
• [文献書誌] Kino T, et al.: "Identification of the cis-acting region in the NF2 gene promoter as a potential target for mutation and methylation-dependent silencing in schwannoma."Genes to Cells. In press.
• [文献書誌] Koga H, et al.: "Biological aspects of the neurofibromatosis type 2 gene product. In Phacomatosis in Japan"H.Nimura,F.Otsuka and O.Hino. 11 (1999)